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Junier, Pilar
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Junier, Pilar
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pilar.junier@unine.ch
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- PublicationAccès libreGenetic and ecological insights of Swiss morels ("Morchella" spp.), including an agricultural perspective(2024)
; Les morilles (Ascomycota, Pezizomycetes, Morchella) sont l'un des rares champignons comestibles que l'on peut ramasser dans la nature et cultiver à l'échelle commerciale. La fructification de la morille est un aliment sain apprécié dans le monde entier pour sa saveur et ses propriétés médicinales. La taxonomie de Morchella est complexe, essentiellement divisées en trois clades principaux (Rufobrunnea, Esculenta, Elata). Les morilles ont également un cycle de vie et un système trophique compliqués, restant partiellement inconnus. Les morilles peuvent se reproduire de manière asexuée, et sexuée en produisant des corps fructifères où se forment les ascospores. Le locus du type d'accouplement (MAT) est le régulateur principal de la reproduction sexuelle, et les gènes qu'il contient informent sur le système de reproduction. Les morilles peuvent être homothalliques, pseudohomothalliques ou hétérothalliques. Les morilles ont été domestiquées au début des années 80 et le processus de culture n'a cessé de s'améliorer. La Chine est actuellement le seul pays à commercialiser des morilles cultivées à grande échelle. En Suisse, les marchés sont approvisionnés en morilles non durables d'un point de vue environnemental et social. La récolte de morilles à l'état sauvage ne peut répondre à la demande, d'où la nécessité de développer la culture de morilles dans le pays. Une souche indigène doit être domestiquée, car l'importation de cultivars non natifs peut entraîner des menaces pour la biodiversité (invasions et hybridation). Il est ainsi essentiel d'étudier les morilles suisses. Cette thèse fournit les premières connaissances nécessaires au développement de la culture des morilles en Suisse. Dans la section 2, la biodiversité des morilles a été évaluée dans neuf cantons. Il en ressort qu'une espèce du clade Esculenta (Morchella esculenta) et trois espèces du clade Elata (Morchella importuna, Morchella deliciosa/Mel-13, complexe d’espèces Morchella pulchella) ont été trouvées. De plus, quatre nouvelles lignées ont été découvertes, l'une d'entre elles étant décrite comme une nouvelle espèce (Morchella helvetica sp. nov.) dans la section 3. La section 4 a évalué un outil d'identification basé sur l'IA (approche Centroïde) qui a permis d'identifier 83 % des espèces de morilles sur la base des séquences génétiques de l'espace transcrit interne (ITS). Cet outil concurrence les analyses phylogénétiques à quatre locus, permettant d'identifier 84% des espèces de morille. Dans les sections 5-6, la reproduction sexuelle des morilles suisses a été étudiée. La fiabilité de quatre paires d'amorces PCR a été testée, les génotypes de reproduction ont été évalués, et la structure génétique du locus MAT a été déterminée en analysant deux génomes entiers séquencés pour cette étude. Ceci a révélé que les morilles suisses étaient principalement hétérothalliques, conformément à la littérature. Les dernières sections ont étudié les interactions biologiques entre Morchella et d'autres organismes du sol. Dans la section 7, les interactions tripartites entre Morchella, Pseudomonas koreensis et une amibe bactériophage Acanthamoeba castellanii ont été étudiées. Cela a révélé une association inattendue entre le champignon et l'amibe. De plus, il a été démontré pour la première fois que P. koreensis peut former un biofilm autour des hyphes de Morchella, et que l'amibe peut utiliser les hyphes comme autoroutes fongiques. La section 8 portait sur le nématode mycophage Aphelenchus avenae et trois contaminants fongiques isolés à partir d'un essai de culture (Penicillium sp., Cephalotrichum sp., Aspergillus westerdijkiae). Morchella avait une résistance naturelle contre les nématodes prédateurs et était plus compétitive que les contaminants. ABSTRACT True morels (Ascomycota, Pezizomycetes, Morchella) are one of the rare edible mushrooms that can be collected in the wild and cultivated at commercial scales. The morel fruiting body is a healthy food appreciated worldwide as gourmet food and for its medicinal properties. Morchella have a complex taxonomy but are basically divided into three main clades (Rufobrunnea, Esculenta, Elata). Morchella also display a complicated lifecycle and trophic system, that remain partially unknown. Morels can reproduce asexually, and sexually by producing ascospores-bearing fruiting bodies. The mating type locus is the master regulator of sexual reproduction, and the genes it contains inform on the reproductive system of an organism. In Morchella, homothallism, pseudohomothallism, and heterothallism exist. Morels were domesticated in the early eighties, and since then the cultivation process has not stopped to improve. China is currently the only country to commercialize cultivated morels at large scale. In Switzerland, markets are provided with environmentally unsustainable and potentially socially unfair morel mushrooms. Harvesting morels in the wild cannot meet the demand, hence the development of cultivation in the Switzerland is needed. A native strain must be domesticated, because importing non-indigenous cultivars can cause biodiversity threats, namely invasiveness and hybridization. To do so, it is crucial to study Swiss morels. This thesis provides the first knowledge background necessary to develop morel cultivation in Switzerland. In section 2, the biodiversity of Morchella was assessed in nine cantons of the country. In this survey one species of the Esculenta clade (Morchella esculenta) and three described species of the Elata clade (Morchella importuna, Morchella deliciosa/Mel-13, Morchella pulchella species complex) were found. In addition, four new lineages were discovered, one of which was described as a new species (Morchella helvetica sp. nov.) in section 3. Section 4 evaluated an AI-based identification tool (the Centroid-based approach) that was able to identify 83% of the morel species based on genetic sequences of the internal transcribed spacer. The performance was comparable with four-locus phylogenetic analyses that were able to identify 84% of the Morchella at species level. In sections 5-6, the sexual reproduction system of Swiss Morchella was investigated. The reliability of four primer pairs was tested, the mating genotype of single-ascospore isolates of Swiss strains was assessed, and the genetic structure of the mating type locus was determined analyzing two whole genomes that were sequenced for this purpose. This revealed that Swiss morels were mainly heterothallic. The last sections investigated biologic interactions between Morchella and other organisms that it could encounter in soil. In section 7, tripartite interactions between Morchella, the bacterium Pseudomonas koreensis, and a bacteriophagous amoeba Acanthamoeba castellanii were investigated. This revealed an unexpected association between the fungus and the amoeba to thrive in the presence of the bacterium. In addition, it was demonstrated for the first time that P. koreensis can form biofilm around Morchella hyphae, and that amoeba can use hypha to facilitate their movement across unsaturated areas of the medium (i.e., fungal highways). Finally, in section 8, the mycophagous nematode Aphelenchus avenae and three fungal contaminants isolated from a fruiting body cultivation assay (Penicillium sp., Cephalotrichum sp., Aspergillus westerdijkiae). Overall, Morchella had a natural resistance against the predatory nematodes and outcompeted the fungal contaminants. - PublicationRestriction temporaireUntapping microbial diversity in geothermal power plantsThe Earth hosts a wide variety of environments that are considered extreme for life, from glaciers to volcanoes or from the deep-sea to the deep terrestrial subsurface. However, even if environmental conditions are extreme in these environments, most of them harbor a great diversity of microbial life. In this thesis, we focused on one particular extreme environment: deep geothermal fluids that are used for electricity production. These fluids present several extreme conditions, such as high temperatures, high salinities, radioactivity or the presence of heavy metals. They are nevertheless known to host bacterial and archaeal life, which can impact the efficacy of geothermal power plants by causing microbially-induced corrosion or microbially-induced mineral precipitation. However, the general access to these deep geothermal fluids (generally a few kilometers below the Earth’s surface) has been limited until recently due to the impossibility to reach them. Therefore, general patterns about the presence of microbial life in deep geothermal fluids are still widely unknown. Moreover, the presence of Fungi in these specific systems was, to the best of our knowledge, never assessed before. Given the impacts that microbial life can have on the geothermal power plants themselves as well as the potential of discovering new microbial species from these underexplored environments, assessing the presence of microorganisms in these systems is of great interest. The aim of this thesis was therefore to assess the bacterial and fungal diversity present in different geothermal power plants producing electricity in Europe. First, as the microbial diversity in extreme environments can be challenging to assess due to the low amount of biomass present and to the existence of multiple resistance strategies of the microorganisms in such an extreme environment, culture-independent methods were tested and validated for deep geothermal fluids. A method previously developed to access the DNA from bacterial and archaeal cells resistant to lysis was validated on fungal structures. Then, this method as well as bioinformatic pipelines to analyze bacterial and fungal sequences from deep geothermal fluids were validated, showing the importance to use DNA extractions from the lysis-resistant and non-resistant community fractions to get a broad overview of the microbial diversity within the samples. Once all the methods were validated, the diversity of Bacteria and Fungi in fluids from six different geothermal power plants was analyzed. This revealed an astonishing diversity for the bacterial and fungal communities, and even the most extreme sites in term of temperature (i.e., the Icelandic geothermal power plants) were shown to host life. Afterwards, in order to complement this overview of the diversity of Bacteria and Fungi detected through molecular methods, isolation of microorganisms from the same geothermal fluids was done. This allowed us to isolate two anaerobic bacterial strains, one aerobic thermophilic strain of Thermaerobacter composti, one new bacterial strain belonging to the Niallia genus, as well as 11 fungal strains that included a strain of Penicillium citrinum and yeasts belonging to the Meyerozyma genus. The strain of P. citrinum, which is a species known for its biosorption potential of heavy metals, was further used in a biosorption experiment. The potential of the dead biomass of this fungus to biosorb lead was assessed under conditions mimicking those found in a geothermal fluid and during operations for electricity production, with the idea to decrease the lead concentration in the fluids, thus lessening the negative impact of lead precipitation within power plant systems. However, this showed that while elevated temperatures or the presence of organic acids within the fluids did not impact biosorption, the high salinity of the geothermal fluids drastically hindered the biosorption capacity of the biomass, making lead removal under these conditions negligeable. Overall, this thesis highlighted the bacterial and fungal life present in deep geothermal fluids of different geothermal power plants across Europe by the combination of culture-independent and culture-dependent methods. This provides a better understanding of the system, thus allowing for a more informed management of microbial life in geothermal power plants. Furthermore, the strains isolated within this thesis, by being either new species or new extremophilic strains of known species, hold the potential to be useful for different biotechnology purposes as well as helping us understand how life adapts to varied extreme conditions.
- PublicationAccès libreOxalotrophy as a biocontrol strategy. New insights in bacterial-fungal interactionsLes champignons phytopathogènes représentent une menace importante pour les cultures et causent chaque année d’importantes pertes économiques. De plus, l’application intensive et systématique de fongicides contribue à la sélection de souches pathogènes résistantes aux antibiotiques. Afin d’assurer le futur de l’agriculture, il est donc nécessaire de développer des stratégies alternatives de lutte contre les pathogènes, telle que le biocontrôle. De nombreux champignons phytopathogènes utilisent les acides organiques à faible poids moléculaire, et en particulier l’acide oxalique, comme facteur de pathogénicité. L’acide oxalique est une molécule aux capacités très polyvalentes, qui est produite principalement par les plantes et les champignons. L’acide oxalique est ubiquiste dans la nature et de nombreuses bactéries, appelées les bactéries oxalotrophes, utilisent l’oxalate (la base conjuguée de l’acide oxalique) comme source de carbone et d’énergie. L’oxalotrophie bactérienne induit une forte alcalinisation et modifie ainsi les capacités physico-chimiques de l’environnement. L’oxalotrophie en tant que stratégie de biocontrôle s’est révélé être très efficace contre les champignons pathogènes oxalogéniques tel que Botrytis cinerea ou Sclerotinia sclerotiorum, deux champignons attaquant des cultures économiquement importantes. L’objectif de cette thèse était donc fournir de nouvelles connaissances sur les interactions bactérie-champignon dans le cas de l’oxalotrophie en tant que stratégie de biocontrôle. Pour ce faire, trois méthodes pour évaluer les interactions entre les spores ou les sclérotes fongiques et les cellules bactériennes ont été développées. Nous avons étudié le contrôle de la germination des spores de B. cinerea par deux bactéries oxalotrophes du sol, Cupriavidus necator et Cupriavidus oxalaticus, avec deux milieux différents, le milieu malt dilué et le milieu Reasoner’s 2. Le premier milieu favorise la croissance fongique, tandis que le second a été initialement développé pour la croissance bactérienne. La production d’acide oxalique et le contrôle de la croissance ont été évalués avec les deux milieux. Le contrôle de la croissance a été efficace seulement avec le milieu Reasoner’s 2 sur boîte (R2A) ou en liquide (R2B), le milieu dans lequel B. cinerea a produit de l’acide oxalique. L’acide oxalique n’a pas été détecté dans le milieu malt liquide (MB1/10). Les deux bactéries étaient capables de contrôler la croissance mycélienne, mais elles étaient incapables de contrôler la germination des spores de B. cinerea. Le biocontrôle a été attribué à la consommation d’acide oxalique, cependant, comme l’oxalotrophie impacte les propriétés physico-chimiques de l’environnement, la prochaine étape de cette étude a été de dissocier la consommation de l’acide oxalique et de l’impact du développement bactérien sur le pH. Afin de déterminer quel effet le changement de pH avait sur la germination et la croissance de S. sclerotiorum, la souche originale du champignon (WT) et une souche mutant incapable de produire de l’acide oxalique (Δoah) ont été confrontées à C. necator et C. oxalaticus sur les deux milieux mentionnés précédemment. Le contrôle de la croissance fongique n’était efficace qu’avec R2B, le milieu dans lequel S. sclerotiorum produisait de l’acide oxalique. S. sclerotiorum Δoah était aussi contrôlé par les bactéries oxalotrophes dans ce milieu, ce qui indiquait que la consommation de l’acide oxalique n’était pas le seul mécanisme derrière le contrôle du champignon. Des recherches supplémentaires ont montré que l’alcalinisation du milieu était responsable du contrôle de la croissance fongique. Durant les expériences de confrontation, des observations au microscope ont montré que C. necator et C. oxalaticus avec un comportement très différent envers le champignon en fonction du milieu de culture utilisé. Avec R2B, les bactéries étaient attirées par le champignon, tandis qu’avec MB1/10, elles étaient clairement repoussées par le mycélium. Des recherches plus poussées ont montré que les bactéries n’étaient pas attirées par le milieu de culture récupéré après la croissance de S. sclerotiorum dans R2B et que l’attraction semblait dépendre d’un métabolite associé au mycélium. Pour ce qui est du métabolite répulsif, nous avons montré qu’il se liait à la poly-l-lysine et qu’il avait des propriétés antibactériennes. Des expériences additionnelles restent à réaliser afin de déterminer la nature du métabolite et son potentiel contre d’autres bactéries à Gram-positif ou négatif. Finalement, des bactérie oxalotrophes sporulantes ont été isolées à partir d’un échantillon de sol afin de déterminer leur efficacité en tant qu’agent de biocontrôle. Plusieurs bactéries ont été isolées. Les isolats étaient identiques à plus de 99% et apparentés à Ammoniphilus oxalaticus, une bactérie sporulante strictement oxalotrophe. La souche isolée, A. oxalaticus strain HJ, était capable de germer et de pousser avec de l’oxalate de calcium (CaOx), de l’oxalate de potassium (KOx) et de l’acide oxalique. Cependant, cette bactérie ne pouvait compléter son cycle de vie (germination, croissance et sporulation) qu’avec CaOx. Afin de déterminer si les concentrations d’acide oxalique produites par B. cinerea et S. sclerotiorum étaient suffisantes pour supporter la croissance de la bactérie, les endospores d’A. oxalaticus strain HJ ont été inoculées en présence de mycélium des deux champignons. Les endospores d’A. oxalaticus strain HJ n’ont germé et poussé qu’en présence de S. sclerotiorum, et les cellules végétatives étaient très actives à proximité du mycélium. Malheureusement, il n’a pas été possible de déterminer le potentiel d’agent de biocontrôle de cette souche durant cette thèse. Les résultats préliminaires montrent que la croissance de S. sclerotiorum était ralentie en présence des cellules végétatives d’A. oxalaticus strain HJ, cependant, il reste encore beaucoup à faire avant de pouvoir déterminer le potentiel d’A. oxalaticus strain HJ en tant qu’agent de biocontrôle contre les champignons pathogènes oxalogènes. ABSTRACT Phytopathogenic fungi are a major threat to crops, and cause important economic losses every year. Furthermore, intensive and systematic fungicide application contributes to select resistant pathogenic strains and it is difficult to develop non-susceptible plant cultivars. In order to ensure the future of the agriculture, there is therefore a necessity to develop alternative pathogen control strategies, such as biocontrol. Many fungal phytopathogens use low molecular weight organic acids, and in particular oxalic acid, as a factor of pathogenicity. Oxalic acid is a highly versatile molecule mainly produced by plants and fungi, and ubiquitously found in nature. Numerous bacterial species can consume oxalate, the conjugated base of oxalic acid, as carbon and energy sources, and are thus called oxalotrophic bacteria. Bacterial oxalotrophy induces a strong alkalinisation locally, therefore modifying the physicochemical properties of the environment. Oxalotrophy as a biocontrol strategy has shown a great potential against oxalogenic phytopathogenic fungi such as Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum, two relevant pathogens for important crops. The aim of this thesis was therefore to provide new insights in bacterial-fungal interactions in the case of oxalotrophy as biocontrol strategy. For this purpose, three methods to assess the interactions occurring between fungal resting structures, such as spores or sclerotia, and bacterial cells were developed. We investigated the control of germination of B. cinerea spores by two oxalotrophic soil bacteria, Cupriavidus necator and Cupriavidus oxalaticus, with two different media, diluted malt medium and Reasoner’s 2 medium. The first medium favours fungal growth, while the second was originally developed for bacterial growth. Oxalic acid production by the fungus and growth control by the bacteria was assessed in both media. Mycelial growth control was only efficient in Reasoner’s 2 agar or broth (R2A; R2B), the medium in which B. cinerea produced oxalic acid. Conversly, no oxalic acid was detected in diluted malt broth (MB1/10) and both bacteriawere able to control the mycelial growth, but not the germination of B. cinerea spores. The control was attributed to the consumption of oxalic acid, however, as oxalotrophy impacts the physicochemical properties of the environment, the next step of this study was to disentangle oxalic acid consumption from the impact of bacterial development on pH. To determine the effect of the pH change on the germination and the mycelial growth of S. sclerotiorum, a wild type (WT) strain of the pathogen and a mutant deficient in oxalic acid production (Δoah) were confronted to C. necator and C.oxalaticus on the aforementioned media. Growth control was efficient only in R2B, the medium in which oxalic acid was produced by S. sclerotiorum WT. However, S. sclerotiorum Δoah was also controlled on this medium, indicating that oxalic acid consumption was not the only mechanism controlling fungal growth. Further investigations showed that media alkalinisation driven by oxalic acid consumption or additional aspects of bacterial metabolism was responsible for the fungal growth control. Observations by microscopy of the interactions occurring during biocontrol assays also showed that C. necator and C. oxalaticus had very different behaviours towards the fungal mycelium depending of the medium used. In R2B, bacteria were attracted to the fungus, while on MB1/10, they were clearly repulsed. Further experiments showed that the bacteria were not attracted by the spent medium of S. sclerotiorum cultures in R2B and that the attraction seemed to be dependant of a metabolite physically associated to the mycelium. For the repulsion, additional experiments showed that the repulsive metabolite had antibacterial properties and could be retrieved by selective binding to poly-l-lysine. Further studies are still required to determine the nature of the metabolite and its antibacterial potential against other Gram-positive and Gram-negative bacteria. Finally, oxalotrophic endospore-forming bacteria (EFB) were isolated from a soil sample in order to assess their efficiency as biocontrol agents. Several oxalotrophic EFB were isolated. All the isolates were identical at more than 99% based on 16S rRNA gene sequencing and were closely related to Ammoniphilus oxalaticus, an obligate oxalotrophic bacterium. The isolated strain, Ammoniphilus oxalaticus strain HJ, was able to germinate and grow with calcium-oxalate (CaOx), potassium-oxalate (KOx) or oxalic acid as carbon source. However, the bacterium was only able to complete its life cycle (germination, growth, and sporulation) with CaOx. The germination and growth of A. oxalaticus strain HJ spores was also assessed in presence of actively growing mycelium of B. cinerea and S. sclerotiorum, in order to determine if the concentration of oxalic acid produced by these two oxalogenic fungi was sufficient to support the growth of A. oxalaticus strain HJ. Endospore germination and growth of A. oxalaticus strain HJ was observed only in the presence of S. sclerotiorum. Vegetative cells were found to be very active in proximity of the mycelium. Unfortunately, the potential of A. oxalaticus strain HJ as biocontrol agent could not be assessed during the course of this thesis. However, preliminary results showed that S. sclerotiorum growth was slowed down in presence of vegetative cells of A. oxalaticus strain HJ. Still, much remains to be investigated to assess the potential of A. oxalaticus strain HJ as biocontrol agent against oxalogenic phytopathogenic fungi.
- PublicationAccès libreCharacterization of the microbial community in raw milk cheese by high-throughput qPCRAu cours des dernières décennies, les méthodes indépendantes de la culture ont été largement utilisées pour la recherche et le diagnostic en microbiologie alimentaire. Ces méthodes permettent une détermination rapide et précise de la composition microbienne d'une variété d'aliments. Récemment, la PCR quantitative (qPCR) et le séquençage de nouvelle génération (NGS), notamment le séquençage des amplicons du gène de l'ARNr 16S, ont été fréquemment utilisés pour étudier la composition microbienne du fromage et son influence sur la qualité du fromage. Cependant, ces méthodes sont relativement complexes et coûteuses pour une utilisation plus répandue, par exemple pour le contrôle de routine de la qualité du fromage dans les fromageries. Un avantage de la qPCR par rapport au NGS est la quantification des espèces bactériennes ciblées dans le fromage; cependant, il y a aussi un désavantage concernant le débit et la couverture de la population bactérienne. Il y a quelques années, le développement de nouvelles technologies dans le domaine de la microfluidique a permis d'augmenter le débit des systèmes qPCR, rendant possible la réalisation d'analyses qPCR sur un plus grand nombre d'échantillons et de tests avec un effort réduit. L'objectif de cette thèse était de développer les bases d'un système qPCR à haut débit (HT-qPCR) pour la quantification d'espèces bactériennes importantes pour la qualité des fromages au lait cru, qui serait applicable pour la recherche ainsi que pour le diagnostic des problèmes de qualité.
Dans ce but, un pipeline automatisé pour la conception d'amorces qPCR spécifiques aux espèces a été développé et validé. Au total, 23 nouveaux systèmes d'amorces ont été conçus pour cibler les espèces bactériennes couramment utilisées dans les starters ou les bactéries lactiques non starters présentes dans les fromages au lait cru. La performance de ces systèmes d'amorces en combinaison avec le système HT-qPCR a été validée en utilisant des extraits d'ADN de cultures bactériennes pures et de fromages modèles inoculés. De plus, les performances de la HT-qPCR et du séquençage des amplicons du gène de l'ARNr 16S ont été comparées pour déterminer la composition microbienne de 21 fromages Raclette du Valais.
Dans cette thèse, les concepts de base du développement d'un système HT-qPCR pour la quantification de certaines des espèces bactériennes les plus importantes pour la qualité du fromage ont été décrits. L'application et l'utilité de ce système pour la recherche microbiologique des aliments fermentés ont été démontrées. Une application potentielle de cette nouvelle approche serait l'étude du développement de la communauté bactérienne pendant la maturation. La poursuite du développement du système modulaire pourrait faciliter le dépistage rapide et économique des espèces bactériennes importantes pour la qualité des fromages avant et pendant la maturation, assurant ainsi un contrôle continu de la qualité pendant la fabrication des fromages au lait cru.
Abstract In recent decades, culture-independent methods have been extensively used for research and diagnostics in food microbiology. These methods allow a rapid and accurate determination of the microbial composition in a variety of foods. Recently, quantitative PCR (qPCR) and next-generation sequencing (NGS), especially 16S rRNA gene amplicon sequencing, were frequently used to investigate the microbial composition of cheese and its influence on cheese quality. However, these methods are relatively complex and expensive for a more widespread use, for instance, for the routine monitoring of cheese quality in cheese dairies. An advantage of qPCR over NGS is the quantification of the targeted bacterial species in cheese; however, there is also a trade-off in throughput and the bacterial population coverage. A few years ago, the development of new technologies in microfluidics enabled higher throughput for qPCR systems, making it possible to perform qPCR analyses on larger numbers of samples and assays with reduced effort. The aim of this thesis was to develop the basis for a high-throughput qPCR (HT-qPCR) system for the quantification of quality-relevant bacterial species in raw milk cheese, which would be applicable for research as well as for the diagnosis of quality problems.
For this purpose, an automated pipeline for the design of species-specific qPCR primers was developed and validated. In total, 23 new primer systems were designed targeting bacterial species commonly used in starters or present as part of the non-starter lactic acid bacteria in raw milk cheeses. The performance of these primer systems in combination with the HT-qPCR system were validated using DNA extracts from pure bacterial cultures and inoculated model cheeses. Further, the performance of HT-qPCR and 16S rRNA gene amplicon sequencing to determine the microbial composition of 21 Raclette du Valais cheeses was compared.
In this thesis, the basic concepts of the development of a HT-qPCR system for the quantification of some of the most important bacterial species with relevance to cheese quality were described. The application and usefulness for microbiological research of fermented foods was demonstrated. A potential application of this novel approach is the study of the bacterial community development during ripening. Further development of the modular system could eventually facilitate the rapid and economical screening of quality-relevant bacterial species in cheeses before and during ripening, thus ensuring continuous quality control during the manufacture of raw milk cheeses. - PublicationAccès libreBiological strategies for the preservation of waterlogged archaelogical woodLe bois archéologique gorgé d'eau est une partie essentielle de notre patrimoine culturel. Les objets en bois qui ont été préservés dans des sites gorgées d'eau fournissent des informations précieuses sur les civilisations passées. Cependant, le bois gorgé d'eau peut rencontrer de graves problèmes après l’excavation. Lorsque des espèces soufrées et de ferreuses se sont formées et accumulées pendant la période d'enfouissement, la précipitation de sels et l'acidification peuvent apparaître après exposition à l'oxygène, entraînant de graves problèmes structurels. Malheureusement, ces altérations sont souvent observées après que les objets aient été consolidés. Des procédés d'extraction chimique ou de neutralisation sont appliqués en réponse a ces problèmes. Actuellement, les nouvelles tendances optent pour des solutions moins toxiques et plus respectueuses de l'environnement. Par exemple, les traitements biologiques appliqués à la préservation d’artéfacts patrimoniaux basé sur le potentiel de divers métabolismes microbiologiques suscitent l’intérêt. Le but de cette thèse est de développer une méthode verte et durable qui éliminerait les composés soufrés et ferreux tout en maintenant la stabilité chimique et la structure physique du bois gorgé d’eau. Il existe peu de références de méthodes biologiques liées à la conservation des substrats organiques. De ce point de vue, l'extraction biotechnologique proposée ici est une approche innovante pour l'élimination des espèces de fer et soufre du bois. Cette méthode originale adopte deux stratégies différentes: 1) l'élimination du fer à l'aide de chélateurs microbiens du fer (sidérophores) et, 2) l'extraction d'espèces soufrées par oxydation avec des bactéries sélectionnées (Thiobacillus denitrificans). Les deux approches ont été étudiées directement sur les phases minérales couramment trouvées dans le bois gorgé d'eau, et sur des échantillons de bois modèles préparés pour simuler le bois archéologique gorgé d'eau. Les deux processus biologiques ont montré des résultats positifs en extrayant des espèces de fer et de soufre à partir d'échantillons de bois modèles. De plus, aucune dégradation supplémentaire du bois n'a été détectée après l'application des méthodes d'extraction. Néanmoins, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour améliorer l'extraction du fer et du soufre car avec des phases minérales plus stables, les taux de dissolution étaient plus faibles. Combinées sur des échantillons de bois modèles, l'utilisation de sidérophores et l'oxydation biologique ont obtenu des résultats dans le cadre des traitements d'extraction chimiques actuels et respectent autant que possible les critères de conservation en termes d'aspect, d'efficacité et de sécurité. Les résultats du traitement biologique sont prometteurs et des efforts futurs seront faits pour améliorer les performances et développer un protocole prêt à l'emploi. ABSTRACT Waterlogged archaeological wood (WAW) is an essential part of our cultural heritage. Woodenobjects that have been preserved in waterlogged conditions provide valuable information about past civilizations. However, WAW may encounter serious issues after recovery. When sulfur and iron species have formed and accumulated during burial time, salts precipitation and acidification can appear after exposition to oxygen, leading to severe structural damages. Unfortunately, these alterations are often observed after objects have been consolidated. In response, chemical extraction or neutralization processes are applied. Currently, new trends are opting for less toxic and more environmentally friendly solutions. For example, bio-based treatments are arousing for the preservation of heritage artefacts based on the potential of diverse microbiological metabolisms. The aim of this thesis is to develop a green and sustainable method that would remove sulfur and iron compounds while maintaining the chemical stability and physical structure of WAW heritage. There are only few references of bio-based methods related to the conservation of organic substrates. Therefore, the biotechnological extraction proposed here is an innovative approach for the removal of iron/sulphur species from wood. This original method adopts two different strategies: 1) the removal of iron using microbial iron chelators (i.e., siderophores) and, 2) the extraction of sulfur species by oxidation with selected bacteria (i.e., Thiobacillus denitrificans). Both approaches were studied directly on mineral phases commonly found in WAW, and on model wood samples prepared to simulate WAW. Separately, both biological processes showed positive results extracting iron and sulfur species from model wood samples. Moreover, no further degradation of the wood matrix was detected after application of either extraction method. Further research is still needed to enhance the extraction of iron and sulfur as with more stable mineral phases the dissolution rates were lower. Combined together on model wood samples, the use of siderophores and biological oxidation performed in line to current chemical extraction methods and respected as much as possible the conservation guidelines in terms of appearance, effectiveness and safety. The bio-based treatment results are promising, and future efforts would be made to improve performance and to develop a ready-to use protocol.
- PublicationAccès libreImproving bio-inoculation for sustainable agriculture(2019)
; La pollution environnementale globale est l’une des plus grandes menaces pour les habitants de la planète. Parmi les différents types de problèmes environnementaux, la présente étude discute de questions liées à l’utilisation intensive des produits agrochimiques dans l’agriculture conventionnelle, en se focalisant sur la santé des plantes et sur les microorganismes du sol en tant que parties intégrantes des écosystèmes terrestres. En agriculture conventionnelle, des pratiques de gestion inadaptées et l’utilisation de produits agrochimiques ont un impact négatif à la fois sur le sol et sur la qualtié de l’eau. La recherche de solutions alternatives durables est ainsi devenue une priorité. Dans la mycorrhizosphère, les microorganismes sont impliqués dans de nombreux processus biologiques bénéfiques soutenant l’ensemble de l’écosystème sol, et sont ainsi considérés comme des acteurs cruciaux du fonctionnement des écosystèmes. Dans cette perspective, une évaluation in vitro des activités favorisant la croissance des plantes (PGP) chez différentes bactéries endosporulantes (EFB), ainsi que chez des champignons ayant différentes niches écologiques. Nous avons trouvé que la plupart des EFB testées possèdent des traits PGP. C’est également le cas des espèces de champignons testées. De plus, la confrontation entre ces bactéries et champignons a donné lieu à différentes interactions (antagonistes, neutres et positif). De manière intéressante, ces observations n’étaient pas uniquement dépendantes des microbes en concurrence, mais également du milieu de culture utilisé, soulignant l’importance du contexte nutritionnel dans les interactions microbiennes. A la suite de l’évaluation in vitro, l’effet PGP sur des plantes de trois différentes souches de Bacillus a été évalué. Différents schémas d’inoculation ont été comparés : chaque souche seule ou sous la forme d’un consortium des trois souches, ainsi que deux types de formes de vie, les cellules végétatives et les endospores. Ensuite, l’effet des bio-inoculants a été mesuré à différents niveaux de complexité, allant de conditions in vitro à un essai en champs. Cette approche par étape a permis de déterminer si des bio-inoculants plus complexes (en comparaison aux souches seules) étaient plus efficaces à stimuler la croissance des plantes, et quel était leur impact sur les communautés microbiennes autochtones. Les résultats obtenus ont démontré que les consortiums étaient plus constants dans la stimulation de la croissance des plantes que les souches seules, même au contact des microbes autochtones du sol. Fait important, les bactéries bio-inoculées n’ont pas affecté la structure des communautés bactériennes natives, comme démontré par l’utilisation de méthodes métagénomiques ciblant les communautés de champignons et de bactéries. Cette thèse a aussi mis en évidence les interactions microbiennes entre des membres de deux règnes, i.e. les bactéries et les champignons. Chacun d’eux joue un rôle crucial dans le fonctionnement des écosystèmes terrestres, et sont connus pour la diversité de leurs modes de nutritions. Cela peut conduire tant à des interactions positives, neutres ou négatives. Dans cette thèse, une interaction antagoniste, c’est à dire le mode de vie mycophage des bactéries, a été étudiée en détail. Lors de la mycophagie, les bactéries obtiennent des nutriments directement d’un champignon vivant, exerçant un impact négatif sur ce partenaire fongique. Les découvertes de ce travail suggèrent que la bactérie Lysinibacillus sphaericus 1003 a un mode de vie mycophage préférentiel vis-à-vis du champignon phytopathogène Rhizoctonia solani, alors qu’il ne nuit pas au champignon saprophyte Trichoderma rossicum. La bactérie peut croître aux dépends du mycélium de R. solani et, plus important, elle a un impact négatif sur la biomasse fongique. Au contraire, et malgré que L. sphaericus 1003 croisse aux dépends de T. rossicum, la bactérie a un impact positif sur la biomasse de T. rossicum. Par conséquent, ce comportement différent vis-à-vis d’un pathogène de plante (R. solani) et d’un champignon bénéfique à la plante (T. rossicum) peut constituer un modèle intéressant pour mieux comprendre le rôle de la mycophagie dans le cycle du carbone dans les sols. Globalement, cette étude apporte de nouvelles connaissances et réflexions au domaine de l’agriculture durable puisqu’elle combine différentes approches de bio-inoculation. Finalement, cette étude contient de nouveaux éléments de discussions proposant des voies pour le développement futur de la stimulation de la croissance des plantes et le biocontrôle par l’utilisation de micro-organismes. ABSTRACT Global environmental pollution is one of the greatest threats to the inhabitants of planet Earth. Among the different types of environmental problems, the present study discusses issues related to the extensive utilization of agrochemicals in conventional agriculture by focusing on plant health and soil microbes as integral parts of terrestrial ecosystems. In conventional agriculture, inappropriate management practices and the use of agrochemicals have led to a negative impact on both soil and water. As a result, the search for sustainable alternatives in agriculture has become a priority. In the mycorrhizosphere, microbes are involved in many beneficial activities supporting the whole soil ecosystem and thus are considered as crucial actors of soil functioning. With such a perspective, an in vitro screening was carried out to evaluate the plant growth promoting (PGP) activities of different endospore forming bacteria (EFB), as well as of fungi with different ecological niches. We found that most of the screened EFB possessed one or more PGP traits. The fungal species that were screened were also positive for PGP traits. Moreover, confrontation of these bacteria and fungi resulted in many different interactions (antagonistic, neutral or positive). Interestingly, these findings did not only depend on the competing microbes, but also on the medium used, pointing at the importance of the nutritional context in microbial interactions. After the in vitro screening, the PGP effect of three different Bacillus strains was assessed in planta. Different bacterial inoculation schemes were compared: each strain alone or the three as a consortium and both life forms, vegetative cells and endospores, were compared. Then, the effect of the bio-inoculants was measured at different levels of complexity, from in vitro conditions to a field trial. This step-wise approach allowed deciphering whether more complex bio-inoculants (as compared to single strains) were more effective in promoting plant growth and whether this had any impact on the autochthonous microbial communities. The results obtained demonstrated that bacterial consortia were more consistent in promoting plant growth than single strains, even when in contact with the autochthonous soil microbes. Importantly, the bio-inoculated bacteria did not affect the structure of the native microbial communities, as demonstrated by using targeted metagenomics on both fungal and bacterial communities. This thesis also highlighted microbial interactions between members belonging to two kingdoms, i.e. bacteria and fungi. Both of them play crucial roles in terrestrial ecosystem functioning and are known for their diversified nutritional capabilities. This can lead to all type of interactions, from positive to negative ones. In this thesis, one antagonistic interaction, the mycophageous life-style of bacteria was investigated in detail. In mycophagy, bacteria obtain nutrients from living fungi and exert a negative impact on the fungal partner. The findings of this work suggest that the bacterium Lysinibacillus sphaericus 1003 has a preferential mycophagous lifestyle towards the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani, while it does not harm the saprophytic Trichoderma rossicum. The bacterium can grow at the expense of the living mycelium of R. solani and, more importantly, has a negative impact on fungal biomass. In contrast, and even though L. sphaericus 1003 grew at the expense of T. rossicum, the bacterium has a positive effect on T. rossicum biomass. Therefore, this differential behavior towards a plant pathogen and a plant beneficial fungus could constitute an interesting model to better understand the role of mycophagy in soil carbon cycling. Overall, this study brings novel insights in the frame of a sustainable exploitation of agricultural ecosystems by combining different types of bio-inoculation methods. Moreover, aspects related to future developments required in the field of plant growth promotion and biocontrol are discussed at the end of this study. - PublicationAccès libreSpore-forming bacteria as a proxy for the reconstruction of past environment and possible use for the detection of antibiotic resistance genes in the environmentPaleoecology is the study of past environments based on the analysis of sedimentary records and their chemical, isotopic and biological composition. Paleoecology aims to establish the relationship between organisms and their physical and chemical environments, in order to assess the causes and rate of ecological change and to reconstruct ecosystem history. Such studies allow for a better understanding of climate variability, range of natural fluctuations, extreme events frequency and/or anthropogenic impact over time, at various time scales. Paleoecological indicators include a wide variety of compounds and structures including mineralogical, chemical and isotopic composition of sediment particles, as well as biological structures such as pollen grain or microfossils (diatoms, ostracods). Environmental DNA has also been proposed as a biological proxy, but DNA-based methods are dependent on DNA conservation. To be applicable, such proxies must be preserved in sediments for long-time periods. That must be the case for bacterial endospores or other spore-like structures. These highly specialized cellular forms allow the organisms able to produce them to resist and survive harsh environmental conditions by entering a dormant state. Such structures have long been proposed as paleoecological proxies, but only the recent development of molecular methods allowing their study results in their potential widespread application for paleoecology. The new-developed methods include notably a DNA extraction protocol adapted to highly resistant structures, and a treatment for the enrichment of spores (spore-separation method). The nature of the spore-separation treatment, which consists in the enrichment of cells able to withstand a harsh lysis method, does not provide direct evidence for the formation of specialized cells, we will use the term “lysis-resistant” instead of spores when appropriate. The first part of this thesis aimed to evaluate the potential of using bacterial DNA, from both the total and the lysis-resistant community, as a proxy for the reconstruction of past environments. First, the efficiency of the newly developed method for the isolation of spores was assessed by comparing the total and the lysis-resistant community. The community composition was compared in samples that have or not been submitted to the spore-separation treatment. The results showed that the lysisresistant community possess a unique signature compared to the total community. Interestingly, various genera hitherto considered as non-sporulating were found in high abundance in the lysisresistant community but were not among the most abundant genera in the total community. This demonstrates a capacity to resist the spore-separation treatment and strongly suggests the ability in these groups of the production of a lysis-resistant structure. Second, the separation method was used to investigate the diversity, distribution, and community structure of potential spore-forming organisms in the environment. To that purpose, data was obtained from four contrasting study sites. The results of our analysis revealed an unsuspected diversity of organisms in the lysis-resistant community. The lysis-resistant community also showed a geographic distribution pattern, challenging a hypothetical cosmopolitan distribution of spore-formers. Results of this study suggest that the ability to form spores or similar resting and durable cell structures is more widespread than previously suspected. In a second study, the application of these novel methods was tested for the reconstruction of the history of the ephemeral Lake Liambezi (Namibia). Using a multidisciplinary approach including the use of bacterial DNA in complement to geochemical and sedimentological analyses, the climate evolution over the past 5500 years was reconstructed. This highlighted an alternation of dry and wet periods, and changes in the hydrological lake regime (from fen to lake). DNA was isolated from both the total and the lysis-resistant fraction of the community, both of which reflected changes in the environmental conditions, demonstrating their relevancy for paleoecological studies. Interestingly, in some cases, putative environmental conditions, biological processes, or extreme events were only seen in one fraction of the community, highlighting the complementarity of investigating both fractions of the community. In addition, the analysis of the bacterial community and specific populations helped to elaborate a coherent age model relating the three sediment cores studied. This analysis suggested hydrothermal activity and sulfur cycling within the lake. Results of this study demonstrated the potential of using bacterial DNA (total and/or spores) to identify changes and variability in the environmental conditions, and the strengths of a multidisciplinary approach to reconstruct ecosystem history. The second part of this thesis aimed to evaluate the possible use of these new-developed methods for studying the prevalence of antibiotic resistance genes (ARG) in the environment. Since the discovery of penicillin by Fleming in 1928 and the development of antibiotics for medical purpose from the 1940s’, the extensive use of antibiotics has created a selection pressure that has contributed to the emergence of antibiotic resistant bacteria (ARB) and multi-resistant bacteria (MRB). The multiplication of such organisms represents a real threat for human health in the future. Long ignored, this problem is now considered as urgent. Although the distribution and frequency of ARG in the environment is widely unknown, it is clear that human activities have an impact in prevalence. In this part of the thesis, the use of DNA extracted from lysis-resistant bacterial cells for tracking ARG in the environment was assessed. In a first study, the accumulation of ARG over time was investigated, in both the total and the lysisresistant community, in sediments from Lake Geneva (CH). The results showed that two selected ARG (tet(W) and sul1) could be detected in both the lysis-resistant and the total fraction of the community. Both genes were found in higher frequency (copies/ng DNA) in the lysis-resistant community of the community compared to the total community, suggesting the lysis-resistant fraction was enriched in ARG. Accumulation patterns of these two ARG showed to be correlated to the historical use of their related antibiotics. When investigating the relationship between the ARG accumulation and the bacterial community composition, each gene appeared to be correlated to different taxonomic group. While tet(W) was mainly correlated to a change in the relative abundance in the Firmicutes, sul1 was correlated to a more diverse group of organisms, suggesting both ARG are differently distributed across bacterial taxa. These results show that spore-like structures can be used to trace back the effect of historical usage of antibiotics on resistance prevalence. In a second study, the impact of wastewater release on the environmental spread of ARG associated to the lysis-resistant community was investigated in wastewater-impacted sediments from the Vidy Bay (CH). The wastewater treatment plant (WWTP) was identified as a source of ARG. The two studied ARG (tet(W) and sul1) were detected in all samples, and their abundance/frequency decreased with increasing distance to the WWTP outlet. ARG levels were correlated to other indicators of wastewater discharge, such as Corg, Ntot and DNA. Both ARG showed to be differently enriched in the lysis-resistant community. Similarly to what had been observed in the first study, tet(W) frequency mainly correlated with the relative abundance of genera belonging to the Firmicutes (Clostridium and Ruminococcus), and sul1 frequency correlated with a large taxonomic spectrum of organisms. The high relative abundance of Clostridium spp., coupled to its correlation with tet(W) frequency, suggested that members of this genus might be a potential vector for tet(W) dissemination. These two studies constituted the first evidence of the possible detection of ARG in spores or lysisresistant structures. DNA extracted from these resilient structures appeared to be a good proxy for assessing the dispersal and the accumulation of ARG over time in environmental samples. Given their high survival ability and propensity for dispersion, this lysis-resistant fraction of the community might receive more attention in the future, for a better understanding of its role in the fate of ARG, and to help implementing appropriate usage management strategies to halt antibiotic resistance and improve their removal during waste treatment.
- PublicationAccès libreBacterial iron reduction and biogenic mineral formation for the stabilization of corroded iron objects(2018)
; ; En raison de la réactivité du fer à certains composés (oxygène, eau, chlore), ce métal pourrait être facilement corrodé et endommagé. De nombreux domaines tels que l'industrie alimentaire ou l'approvisionnement en eau rencontrent de graves problèmes dus à la corrosion du fer. La corrosion du fer engendre ainsi des pertes économiques importantes. Cela concerne aussi le patrimoine culturel où les objets en fer et surtout les objets archéologiques souffrent également de la corrosion et peuvent être détruits de façon irréversible. Afin de remédier à ces problèmes de corrosion, différentes méthodes conventionnelles de conservation-restauration existent. Cependant, ces techniques présentent certains inconvénients ou ne sont pas totalement efficaces en termes d’inhibition de la corrosion ou de déchloruration des objets. De nos jours, l'utilisation de la biotechnologie représente une approche prometteuse. En effet, il y a un intérêt croissant pour la synthèse de composés inorganiques par des systèmes biologiques dans des processus qui sont respectueux de l’environnement et des personnes. L'utilisation de micro-organismes ayant la capacité de transformer des produits de corrosion réactifs en composés chimiquement stables et insolubles avec un volume molaire inférieur représente une approche alternative aux méthodes traditionnelles utilisées dans le domaine de la conservation du fer. L'objectif global de cette étude est de contribuer au développement d'une approche biotechnologique pour la conservation-restauration des éléments en fer corrodés (monuments extérieurs et objets archéologiques). Pour cela, la réduction du fer par les bactéries a été choisie comme processus métabolique sous-jacent à la transformation des produits de corrosion réactifs (principalement akaganeite et lépidocrocite présents sur les objets en fer corrodés) en minéraux de Fe(II) (tels que magnétite et sidérite). L'hypothèse testée considère qu'en utilisant des bactéries réductrices du fer, des minéraux Fe(II) biogéniques seront formés permettant la conversion des produits de corrosion présents sur les objets, et qu’ainsi les objets en fer seront stabilisés et empêchés de corrosion ultérieure. Deux principales stratégies ont été étudiées au cours de ce projet. La première approche étant l'utilisation de Shewanella loihica comme modèle de bactérie réductrice du fer, notamment car elle est également connue pour être anaérobe facultative, halophile et a été utilisée pour la production de minéraux de Fe(II) dans d'autres études. Au cours de ce projet de doctorat, des résultats additionnels intéressants ont été obtenus : la réduction du fer avec S. loihica n'était possible qu'en présence de NaCl et des phosphates de Fe(II) inattendus se sont formés. La pertinence du processus de stabilisation proposé a donc été démontrée et complétée par l'étude du rôle du sel dans la réduction du fer et de l'accumulation de polyphosphates dans cet organisme. La deuxième approche consistait à isoler à partir d'échantillons environnementaux d’autres candidats bactériens réduisant le fer. L’échantillonnage a abouti à la sélection de deux de deux souches du genre Aeromonas. Les deux souches isolées ont été alors employées dans la démonstration expérimentale du processus de réduction du fer sur des objets archéologiques une avec ces deux bactéries sélectionnées permettant la mise en place d'un prototype de traitement applicable par les conservateurs-restaurateurs. ABSTRACT Due to the reactivity of iron to some compounds (oxygen, water, chlorine), this metal could be easily corroded and thus endangered. Many fields like food industry or water supply encounter severe problems due to iron corrosion that engenders important economic losses. In cultural heritage, iron artifacts and especially archaeological iron objects suffer from corrosion and could be irreversibly damaged. In order to remediate to these issues, different conventional conservation-restoration methods exist. However, these techniques present some caveats and/or are not completely efficient in terms of chlorine removal or corrosion inhibition. Nowadays, the use of biotechnology represents a promising approach. Indeed, there is a growing interest in the synthesis of inorganic components by biological systems in processes that are respectful of the environment. The use of microorganisms with the ability to transform reactive corrosion products into chemically stable and insoluble compounds with a lower molar volume represents an alternative approach to the traditional methods employed in the field of iron conservation. The overall aim of this study is to contribute to the development of a biotechnological approach for the conservation-restoration of corroded iron items (outdoor monuments and archaeological objects). For this purpose, iron reduction by bacteria was selected as an interesting metabolic process underlying the transformation of Fe(III) corrosion products (such as akageneite and lepidocrocite present in corroded iron objects) into Fe(II) minerals (such as magnetite and siderite). The hypothesis tested considers that using iron-reducing bacteria, biologically-induced Fe(II) minerals will be formed from the corrosion products present on the objects and thus these latter will be stabilized and protected further corrosion. Two main strategies were considered during this project. The first approach was the study of a known bacterium Shewanella loihica as a model iron reducer given that it is known to be a facultative anaerobe, halophilic and was used for the production of Fe(II) minerals in other studies. During this PhD project, interesting additional results were obtained: the iron reduction with S. loihica was solely possible in presence of NaCl and unexpected Fe(II) phosphate minerals were formed. The suitability of the proposed stabilization process was hence demonstrated and complemented with the investigation of the role of salt on iron reduction and of the accumulation of polyphosphates in this micro-organism. The second approach was the isolation of iron-reducing bacterial candidates from environmental samples. The screening resulted in the selection of two strains from the genus Aeromonas. Both isolated strains were employed in the experimental testing of the iron reduction process on archaeological objects allowing the setting-up of a prototype treatment that can be applied by conservator-restorers. - PublicationAccès libreFungal biogenic patina: optimization of an innovative conservation treatment for copper-based artefacts(2017)
; Les micro-organismes sont souvent considérés dangereux pour les biens culturels. Malgré cela, ils peuvent aussi être utilisés pour leur protection. En effet, certaines espèces fongiques sont connues pour leur capacité à produire de l'acide oxalique pour immobiliser des métaux lourds toxiques et, donc, détoxifier leur milieu. La biotechnologie a déjà exploité cette capacité d'immobiliser des métaux lourds sous forme d’oxalates métalliques dans le domaine du traitement des déchets. Le projet « biopatine » a tiré profit cette capacité pour modifier des produits de corrosion de cuivre actifs en des composés plus stables et moins solubles comme les oxalates de cuivre. La présence des oxalates de cuivre a été déjà observée sous forme de patines vertes sur des œuvres d’art en bronze à l’extérieur et ils n'ont pas été associés à de la corrosion cyclique. En outre, les oxalates de cuivre sont connus pour être extrêmement stables dans des atmosphères polluées en conditions acides (pH 3), fournissant une bonne protection aux sculptures à base de cuivre. Le projet « biopatine » a comme objectif la production de’ oxalates de cuivre comme composés passivant ayant la même composition que des minéraux de cuivre naturellement présents sur le patrimoine cuivreux (matériaux inorganiques) et l'amélioration de la compatibilité entre le traitement e la surface corrodée. Lors de projets précédents (FP6-EU-ARTECH, 2004-2009 et FP7-BAHAMAS, 2010-2012), l'espèce fongique la plus appropriée a été identifiée et des tentatives de production d’oxalates de cuivre ont été effectuées avec succès. L’objectif de cette thèse était d’optimiser le nouveau traitement biologique développé pour la conservation d’œuvres d’art en cuivre afin de transférer les tests de laboratoire à une mise ne pratique sur le terrain. Ce travail de thèse s'est concentré sur deux sujets principaux : l'étude du micro-organisme utilisé pour la production des oxalates de cuivre biogéniques et les matériaux traités, notamment cuivre et bronze. En ce qui concerne les matériaux traités, le but était de comprendre quels mécanismes protecteurs sont impliqués dans le traitement biopatine permettant de déterminer si ce traitement agit comme un inhibiteur de corrosion ou comme un coating. Le traitement biologique a été comparé à des traitements de conservation standards, la cire microcristalline comme coating et le benzotriazole comme inhibiteur de corrosion, et son comportement à long terme a été évalué par des procédures de vieillissement naturel et artificiel. En outre, l'influence des éléments de l’alliage, l’étain en particulier, sur le comportement du traitement biopatine a été examinée. Pour ce faire, un complément de techniques analytiques a été utilisé: chromatographie liquide à haute performance (HPLC), microscopie optique (OM), microscopie électronique à balayage (SEM) couplé avec spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDS), spectroscopie infrarouge (FTIR), spectroscopie Raman, Spectroscopie d'Impédance Electrochimique (EIS) et colorimétrie. Les résultats de ce travail ont montré que le traitement biopatine se place parmi les inhibiteurs de corrosion plutôt que les revêtements. Le traitement biopatine peut aussi être utilisé pour remplacer le benzotriazole (BTA) comme traitement sans risques pour la santé et l’environnement et plus efficace pour la stabilisation des objets archéologiques. Il peut aussi être appliqué sur des objets en extérieur et son efficacité n'est pas influencée par la composition de l’alliage. En outre, le protocole d'application actuellement utilisé sur des artefacts réels a été développé. Finalement, basé sur les résultats de cette étude, un kit prêt à l'emploi est actuellement en évaluation pour une commercialisation et est mis à disposition des x conservateurs-restaurateurs., Microorganisms are often considered harmful for cultural heritage. However, they can also be used for its safeguarding. Indeed, some fungal species are known for their ability to produce oxalic acid in order to immobilize of toxic heavy metals and, therefore, detoxify their environmental. Biotechnology already exploited this ability to immobilize heavy metals in the field of waste treatment forming metal oxalates. The “biopatina project” used this ability in order to modify active copper corrosion products into more stable and less soluble compounds such as copper oxalates. The presence of copper oxalates as green patinas was already discovered on outdoor bronze artefacts and it was not associated with active corrosion. Furthermore, copper oxalates are known to be extremely stable in polluted atmospheres with acidic conditions (pH 3), providing good protection to copper-based artefacts. The “biopatina project” aims to produce copper oxalates as passivating compound having the same composition as naturally occurring copper minerals (inorganic materials) enhancing the compatibility of this treatment with the corroded surface of artefacts. During previous projects (FP6-EU-ARTECH, 2004-2009 and FP7-BAHAMAS, 2010-2012), the most suitable fungal specie to be used was identified and initial successful attempts to produce copper oxalates were performed. The aim of this thesis was to optimise this novel biological treatment for the conservation copper-based artefact in order to transfer it from the laboratory tests to real-praxis. This work focused on two main subjects: the study of the microorganism used for the production of biogenic copper oxalates and the treated material, namely copper and bronze. Regarding the treated material, the aim was to understand which protective mechanisms are involved in the biopatina treatment allowing to understand if such treatment acts as a corrosion inhibitor or as a coating. The biological treatment was compared to standard conservation treatment as microcrystalline wax (coating system) and benzotriazole (corrosion inhibitor) and its long-term behaviour was tested by natural and artificial ageing. Furthermore, the influence of alloying elements, particularly tin, on the behaviour of biopatina treatment was investigated. To do that, a complement of analytical techniques was used: high-performance liquid chromatography (HPLC), optical microscopy (OM), scanning electron microscopy (SEM) coupled with energy dispersive spectroscopy (EDS), infrared spectroscopy (FTIR), Raman spectroscopy, electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and colorimetry. The outcomes of this work showed that the biopatina treatment is positioned in the range of corrosion inhibitors rather than protective coatings. Biopatina treatment can be used to replace benzotriazole (BTA) solutions as innocuous and more efficient treatment for archaeological objects. It can also be applied on outdoor objects, regardless the geometry of exposure conditions and its efficiency is not influenced by the bronze composition. Furthermore, the application protocol currently used on real artefacts was developed. Finally, based on the outcome of this study, a ready-to-use kit is currently under evaluation for commercialization and available for small trials to conservators-restorers. - PublicationAccès librePhysical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells(2016)
; ; ; Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.