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Oxalotrophy as a biocontrol strategy. New insights in bacterial-fungal interactions
Auteur(s)
Editeur(s)
Maison d'édition
Neuchâtel : Université de Neuchâtel
Date de parution
2023
Nombre de page
193
Mots-clés
- Acide oxalique
- Botrytis cinerea
- Sclerotinia sclerotiorum
- Cupriavidus spp.
- champignons phytopathogènes
- agent de biocontrol bactérien
- expériences in-vitro
- bactéries sporulantes
- Ammoniphilus oxalaticus
- composé antimicrobien
- Oxalic acid
- phytopathogenic fungi
- bacterial biocontrol agent
- in-vitro experiments
- endospore-forming bacteria
- antimicrobial compound
Acide oxalique
Botrytis cinerea
Sclerotinia sclerotio...
Cupriavidus spp.
champignons phytopath...
agent de biocontrol b...
expériences in-vitro
bactéries sporulantes...
Ammoniphilus oxalatic...
composé antimicrobien...
Oxalic acid
phytopathogenic fungi...
bacterial biocontrol ...
in-vitro experiments
endospore-forming bac...
antimicrobial compoun...
Résumé
Les champignons phytopathogènes représentent une menace importante pour les cultures et causent chaque année d’importantes pertes économiques. De plus, l’application intensive et systématique de fongicides contribue à la sélection de souches pathogènes résistantes aux antibiotiques. Afin d’assurer le futur de l’agriculture, il est donc nécessaire de développer des stratégies alternatives de lutte contre les pathogènes, telle que le biocontrôle. De nombreux champignons phytopathogènes utilisent les acides organiques à faible poids moléculaire, et en particulier l’acide oxalique, comme facteur de pathogénicité. L’acide oxalique est une molécule aux capacités très polyvalentes, qui est produite principalement par les plantes et les champignons. L’acide oxalique est ubiquiste dans la nature et de nombreuses bactéries, appelées les bactéries oxalotrophes, utilisent l’oxalate (la base conjuguée de l’acide oxalique) comme source de carbone et d’énergie. L’oxalotrophie bactérienne induit une forte alcalinisation et modifie ainsi les capacités physico-chimiques de l’environnement.
L’oxalotrophie en tant que stratégie de biocontrôle s’est révélé être très efficace contre les champignons pathogènes oxalogéniques tel que Botrytis cinerea ou Sclerotinia sclerotiorum, deux champignons attaquant des cultures économiquement importantes. L’objectif de cette thèse était donc fournir de nouvelles connaissances sur les interactions bactérie-champignon dans le cas de l’oxalotrophie en tant que stratégie de biocontrôle.
Pour ce faire, trois méthodes pour évaluer les interactions entre les spores ou les sclérotes fongiques et les cellules bactériennes ont été développées. Nous avons étudié le contrôle de la germination des spores de B. cinerea par deux bactéries oxalotrophes du sol, Cupriavidus necator et Cupriavidus oxalaticus, avec deux milieux différents, le milieu malt dilué et le milieu Reasoner’s 2. Le premier milieu favorise la croissance fongique, tandis que le second a été initialement développé pour la croissance bactérienne. La production d’acide oxalique et le contrôle de la croissance ont été évalués avec les deux milieux. Le contrôle de la croissance a été efficace seulement avec le milieu Reasoner’s 2 sur boîte (R2A) ou en liquide (R2B), le milieu dans lequel B. cinerea a produit de l’acide oxalique. L’acide oxalique n’a pas été détecté dans le milieu malt liquide (MB1/10). Les deux bactéries étaient capables de contrôler la croissance mycélienne, mais elles étaient incapables de contrôler la germination des spores de B. cinerea. Le biocontrôle a été attribué à la consommation d’acide oxalique, cependant, comme l’oxalotrophie impacte les propriétés physico-chimiques de l’environnement, la prochaine étape de cette étude a été de dissocier la consommation de l’acide oxalique et de l’impact du développement bactérien sur le pH.
Afin de déterminer quel effet le changement de pH avait sur la germination et la croissance de S. sclerotiorum, la souche originale du champignon (WT) et une souche mutant incapable de produire de l’acide oxalique (Δoah) ont été confrontées à C. necator et C. oxalaticus sur les deux milieux mentionnés précédemment. Le contrôle de la croissance fongique n’était efficace qu’avec R2B, le milieu dans lequel S. sclerotiorum produisait de l’acide oxalique. S. sclerotiorum Δoah était aussi contrôlé par les bactéries oxalotrophes dans ce milieu, ce qui indiquait que la consommation de l’acide oxalique n’était pas le seul mécanisme derrière le contrôle du champignon. Des recherches supplémentaires ont montré que l’alcalinisation du milieu était responsable du contrôle de la croissance fongique. Durant les expériences de confrontation, des observations au microscope ont montré que C. necator et C. oxalaticus avec un comportement très différent envers le champignon en fonction du milieu de culture utilisé. Avec R2B, les bactéries étaient attirées par le champignon, tandis qu’avec MB1/10, elles étaient clairement repoussées par le mycélium. Des recherches plus poussées ont montré que les bactéries n’étaient pas attirées par le milieu de culture récupéré après la croissance de S. sclerotiorum dans R2B et que l’attraction semblait dépendre d’un métabolite associé au mycélium. Pour ce qui est du métabolite répulsif, nous avons montré qu’il se liait à la poly-l-lysine et qu’il avait des propriétés antibactériennes. Des expériences additionnelles restent à réaliser afin de déterminer la nature du métabolite et son potentiel contre d’autres bactéries à Gram-positif ou négatif.
Finalement, des bactérie oxalotrophes sporulantes ont été isolées à partir d’un échantillon de sol afin de déterminer leur efficacité en tant qu’agent de biocontrôle. Plusieurs bactéries ont été isolées. Les isolats étaient identiques à plus de 99% et apparentés à Ammoniphilus oxalaticus, une bactérie sporulante strictement oxalotrophe. La souche isolée, A. oxalaticus strain HJ, était capable de germer et de pousser avec de l’oxalate de calcium (CaOx), de l’oxalate de potassium (KOx) et de l’acide oxalique. Cependant, cette bactérie ne pouvait compléter son cycle de vie (germination, croissance et sporulation) qu’avec CaOx. Afin de déterminer si les concentrations d’acide oxalique produites par B. cinerea et S. sclerotiorum étaient suffisantes pour supporter la croissance de la bactérie, les endospores d’A. oxalaticus strain HJ ont été inoculées en présence de mycélium des deux champignons. Les endospores d’A. oxalaticus strain HJ n’ont germé et poussé qu’en présence de S. sclerotiorum, et les cellules végétatives étaient très actives à proximité du mycélium. Malheureusement, il n’a pas été possible de déterminer le potentiel d’agent de biocontrôle de cette souche durant cette thèse. Les résultats préliminaires montrent que la croissance de S. sclerotiorum était ralentie en présence des cellules végétatives d’A. oxalaticus strain HJ, cependant, il reste encore beaucoup à faire avant de pouvoir déterminer le potentiel d’A. oxalaticus strain HJ en tant qu’agent de biocontrôle contre les champignons pathogènes oxalogènes.
ABSTRACT
Phytopathogenic fungi are a major threat to crops, and cause important economic losses every year. Furthermore, intensive and systematic fungicide application contributes to select resistant pathogenic strains and it is difficult to develop non-susceptible plant cultivars. In order to ensure the future of the agriculture, there is therefore a necessity to develop alternative pathogen control strategies, such as biocontrol. Many fungal phytopathogens use low molecular weight organic acids, and in particular oxalic acid, as a factor of pathogenicity. Oxalic acid is a highly versatile molecule mainly produced by plants and fungi, and ubiquitously found in nature. Numerous bacterial species can consume oxalate, the conjugated base of oxalic acid, as carbon and energy sources, and are thus called oxalotrophic bacteria. Bacterial oxalotrophy induces a strong alkalinisation locally, therefore modifying the physicochemical properties of the environment. Oxalotrophy as a biocontrol strategy has shown a great potential against oxalogenic phytopathogenic fungi such as Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum, two relevant pathogens for important crops.
The aim of this thesis was therefore to provide new insights in bacterial-fungal interactions in the case of oxalotrophy as biocontrol strategy. For this purpose, three methods to assess the interactions occurring between fungal resting structures, such as spores or sclerotia, and bacterial cells were developed. We investigated the control of germination of B. cinerea spores by two oxalotrophic soil bacteria, Cupriavidus necator and Cupriavidus oxalaticus, with two different media, diluted malt medium and Reasoner’s 2 medium. The first medium favours fungal growth, while the second was originally developed for bacterial growth. Oxalic acid production by the fungus and growth control by the bacteria was assessed in both media. Mycelial growth control was only efficient in Reasoner’s 2 agar or broth (R2A; R2B), the medium in which B. cinerea produced oxalic acid.
Conversly, no oxalic acid was detected in diluted malt broth (MB1/10) and both bacteriawere able to control the mycelial growth, but not the germination of B. cinerea spores. The control was attributed to the consumption of oxalic acid, however, as oxalotrophy impacts the physicochemical properties of the environment, the next step of this study was to disentangle oxalic acid consumption from the impact of bacterial development on pH. To determine the effect of the pH change on the germination and the mycelial growth of S. sclerotiorum, a wild type (WT) strain of the pathogen and a mutant deficient in oxalic acid production (Δoah) were confronted to C. necator and C.oxalaticus on the aforementioned media. Growth control was efficient only in R2B, the medium in which oxalic acid was produced by S. sclerotiorum WT. However, S. sclerotiorum Δoah was also controlled on this medium, indicating that oxalic acid consumption was not the only mechanism controlling fungal growth. Further investigations showed that media alkalinisation driven by oxalic acid consumption or additional aspects of bacterial metabolism was responsible for the fungal growth control. Observations by microscopy of the interactions occurring during biocontrol assays also showed that C. necator and C. oxalaticus had very different behaviours towards the fungal mycelium depending of the medium used. In R2B, bacteria were attracted to the fungus, while on MB1/10, they were clearly repulsed. Further experiments showed that the bacteria were not attracted by the spent medium of S. sclerotiorum cultures in R2B and that the attraction seemed to be dependant of a metabolite physically associated to the mycelium. For the repulsion, additional experiments showed that the repulsive metabolite had antibacterial properties and could be retrieved by selective binding to poly-l-lysine.
Further studies are still required to determine the nature of the metabolite and its antibacterial potential against other Gram-positive and Gram-negative bacteria. Finally, oxalotrophic endospore-forming bacteria (EFB) were isolated from a soil sample in order to assess their efficiency as biocontrol agents. Several oxalotrophic EFB were isolated.
All the isolates were identical at more than 99% based on 16S rRNA gene sequencing and were closely related to Ammoniphilus oxalaticus, an obligate oxalotrophic bacterium. The isolated strain, Ammoniphilus oxalaticus strain HJ, was able to germinate and grow with calcium-oxalate (CaOx), potassium-oxalate (KOx) or oxalic acid as carbon source. However, the bacterium was only able to complete its life cycle (germination, growth, and sporulation) with CaOx. The germination and growth of A. oxalaticus strain HJ spores was also assessed in presence of actively growing mycelium of B. cinerea and S. sclerotiorum, in order to determine if the concentration of oxalic acid produced by these two oxalogenic fungi was sufficient to support the growth of A. oxalaticus strain HJ. Endospore germination and growth of A. oxalaticus strain HJ was observed only in the presence of S. sclerotiorum. Vegetative cells were found to be very active in proximity of the mycelium. Unfortunately, the potential of A. oxalaticus strain HJ as biocontrol agent could not be assessed during the course of this thesis. However, preliminary results showed that S. sclerotiorum growth was slowed down in presence of vegetative cells of A. oxalaticus strain HJ. Still, much remains to be investigated to assess the potential of A. oxalaticus strain HJ as biocontrol agent against oxalogenic phytopathogenic fungi.
L’oxalotrophie en tant que stratégie de biocontrôle s’est révélé être très efficace contre les champignons pathogènes oxalogéniques tel que Botrytis cinerea ou Sclerotinia sclerotiorum, deux champignons attaquant des cultures économiquement importantes. L’objectif de cette thèse était donc fournir de nouvelles connaissances sur les interactions bactérie-champignon dans le cas de l’oxalotrophie en tant que stratégie de biocontrôle.
Pour ce faire, trois méthodes pour évaluer les interactions entre les spores ou les sclérotes fongiques et les cellules bactériennes ont été développées. Nous avons étudié le contrôle de la germination des spores de B. cinerea par deux bactéries oxalotrophes du sol, Cupriavidus necator et Cupriavidus oxalaticus, avec deux milieux différents, le milieu malt dilué et le milieu Reasoner’s 2. Le premier milieu favorise la croissance fongique, tandis que le second a été initialement développé pour la croissance bactérienne. La production d’acide oxalique et le contrôle de la croissance ont été évalués avec les deux milieux. Le contrôle de la croissance a été efficace seulement avec le milieu Reasoner’s 2 sur boîte (R2A) ou en liquide (R2B), le milieu dans lequel B. cinerea a produit de l’acide oxalique. L’acide oxalique n’a pas été détecté dans le milieu malt liquide (MB1/10). Les deux bactéries étaient capables de contrôler la croissance mycélienne, mais elles étaient incapables de contrôler la germination des spores de B. cinerea. Le biocontrôle a été attribué à la consommation d’acide oxalique, cependant, comme l’oxalotrophie impacte les propriétés physico-chimiques de l’environnement, la prochaine étape de cette étude a été de dissocier la consommation de l’acide oxalique et de l’impact du développement bactérien sur le pH.
Afin de déterminer quel effet le changement de pH avait sur la germination et la croissance de S. sclerotiorum, la souche originale du champignon (WT) et une souche mutant incapable de produire de l’acide oxalique (Δoah) ont été confrontées à C. necator et C. oxalaticus sur les deux milieux mentionnés précédemment. Le contrôle de la croissance fongique n’était efficace qu’avec R2B, le milieu dans lequel S. sclerotiorum produisait de l’acide oxalique. S. sclerotiorum Δoah était aussi contrôlé par les bactéries oxalotrophes dans ce milieu, ce qui indiquait que la consommation de l’acide oxalique n’était pas le seul mécanisme derrière le contrôle du champignon. Des recherches supplémentaires ont montré que l’alcalinisation du milieu était responsable du contrôle de la croissance fongique. Durant les expériences de confrontation, des observations au microscope ont montré que C. necator et C. oxalaticus avec un comportement très différent envers le champignon en fonction du milieu de culture utilisé. Avec R2B, les bactéries étaient attirées par le champignon, tandis qu’avec MB1/10, elles étaient clairement repoussées par le mycélium. Des recherches plus poussées ont montré que les bactéries n’étaient pas attirées par le milieu de culture récupéré après la croissance de S. sclerotiorum dans R2B et que l’attraction semblait dépendre d’un métabolite associé au mycélium. Pour ce qui est du métabolite répulsif, nous avons montré qu’il se liait à la poly-l-lysine et qu’il avait des propriétés antibactériennes. Des expériences additionnelles restent à réaliser afin de déterminer la nature du métabolite et son potentiel contre d’autres bactéries à Gram-positif ou négatif.
Finalement, des bactérie oxalotrophes sporulantes ont été isolées à partir d’un échantillon de sol afin de déterminer leur efficacité en tant qu’agent de biocontrôle. Plusieurs bactéries ont été isolées. Les isolats étaient identiques à plus de 99% et apparentés à Ammoniphilus oxalaticus, une bactérie sporulante strictement oxalotrophe. La souche isolée, A. oxalaticus strain HJ, était capable de germer et de pousser avec de l’oxalate de calcium (CaOx), de l’oxalate de potassium (KOx) et de l’acide oxalique. Cependant, cette bactérie ne pouvait compléter son cycle de vie (germination, croissance et sporulation) qu’avec CaOx. Afin de déterminer si les concentrations d’acide oxalique produites par B. cinerea et S. sclerotiorum étaient suffisantes pour supporter la croissance de la bactérie, les endospores d’A. oxalaticus strain HJ ont été inoculées en présence de mycélium des deux champignons. Les endospores d’A. oxalaticus strain HJ n’ont germé et poussé qu’en présence de S. sclerotiorum, et les cellules végétatives étaient très actives à proximité du mycélium. Malheureusement, il n’a pas été possible de déterminer le potentiel d’agent de biocontrôle de cette souche durant cette thèse. Les résultats préliminaires montrent que la croissance de S. sclerotiorum était ralentie en présence des cellules végétatives d’A. oxalaticus strain HJ, cependant, il reste encore beaucoup à faire avant de pouvoir déterminer le potentiel d’A. oxalaticus strain HJ en tant qu’agent de biocontrôle contre les champignons pathogènes oxalogènes.
ABSTRACT
Phytopathogenic fungi are a major threat to crops, and cause important economic losses every year. Furthermore, intensive and systematic fungicide application contributes to select resistant pathogenic strains and it is difficult to develop non-susceptible plant cultivars. In order to ensure the future of the agriculture, there is therefore a necessity to develop alternative pathogen control strategies, such as biocontrol. Many fungal phytopathogens use low molecular weight organic acids, and in particular oxalic acid, as a factor of pathogenicity. Oxalic acid is a highly versatile molecule mainly produced by plants and fungi, and ubiquitously found in nature. Numerous bacterial species can consume oxalate, the conjugated base of oxalic acid, as carbon and energy sources, and are thus called oxalotrophic bacteria. Bacterial oxalotrophy induces a strong alkalinisation locally, therefore modifying the physicochemical properties of the environment. Oxalotrophy as a biocontrol strategy has shown a great potential against oxalogenic phytopathogenic fungi such as Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum, two relevant pathogens for important crops.
The aim of this thesis was therefore to provide new insights in bacterial-fungal interactions in the case of oxalotrophy as biocontrol strategy. For this purpose, three methods to assess the interactions occurring between fungal resting structures, such as spores or sclerotia, and bacterial cells were developed. We investigated the control of germination of B. cinerea spores by two oxalotrophic soil bacteria, Cupriavidus necator and Cupriavidus oxalaticus, with two different media, diluted malt medium and Reasoner’s 2 medium. The first medium favours fungal growth, while the second was originally developed for bacterial growth. Oxalic acid production by the fungus and growth control by the bacteria was assessed in both media. Mycelial growth control was only efficient in Reasoner’s 2 agar or broth (R2A; R2B), the medium in which B. cinerea produced oxalic acid.
Conversly, no oxalic acid was detected in diluted malt broth (MB1/10) and both bacteriawere able to control the mycelial growth, but not the germination of B. cinerea spores. The control was attributed to the consumption of oxalic acid, however, as oxalotrophy impacts the physicochemical properties of the environment, the next step of this study was to disentangle oxalic acid consumption from the impact of bacterial development on pH. To determine the effect of the pH change on the germination and the mycelial growth of S. sclerotiorum, a wild type (WT) strain of the pathogen and a mutant deficient in oxalic acid production (Δoah) were confronted to C. necator and C.oxalaticus on the aforementioned media. Growth control was efficient only in R2B, the medium in which oxalic acid was produced by S. sclerotiorum WT. However, S. sclerotiorum Δoah was also controlled on this medium, indicating that oxalic acid consumption was not the only mechanism controlling fungal growth. Further investigations showed that media alkalinisation driven by oxalic acid consumption or additional aspects of bacterial metabolism was responsible for the fungal growth control. Observations by microscopy of the interactions occurring during biocontrol assays also showed that C. necator and C. oxalaticus had very different behaviours towards the fungal mycelium depending of the medium used. In R2B, bacteria were attracted to the fungus, while on MB1/10, they were clearly repulsed. Further experiments showed that the bacteria were not attracted by the spent medium of S. sclerotiorum cultures in R2B and that the attraction seemed to be dependant of a metabolite physically associated to the mycelium. For the repulsion, additional experiments showed that the repulsive metabolite had antibacterial properties and could be retrieved by selective binding to poly-l-lysine.
Further studies are still required to determine the nature of the metabolite and its antibacterial potential against other Gram-positive and Gram-negative bacteria. Finally, oxalotrophic endospore-forming bacteria (EFB) were isolated from a soil sample in order to assess their efficiency as biocontrol agents. Several oxalotrophic EFB were isolated.
All the isolates were identical at more than 99% based on 16S rRNA gene sequencing and were closely related to Ammoniphilus oxalaticus, an obligate oxalotrophic bacterium. The isolated strain, Ammoniphilus oxalaticus strain HJ, was able to germinate and grow with calcium-oxalate (CaOx), potassium-oxalate (KOx) or oxalic acid as carbon source. However, the bacterium was only able to complete its life cycle (germination, growth, and sporulation) with CaOx. The germination and growth of A. oxalaticus strain HJ spores was also assessed in presence of actively growing mycelium of B. cinerea and S. sclerotiorum, in order to determine if the concentration of oxalic acid produced by these two oxalogenic fungi was sufficient to support the growth of A. oxalaticus strain HJ. Endospore germination and growth of A. oxalaticus strain HJ was observed only in the presence of S. sclerotiorum. Vegetative cells were found to be very active in proximity of the mycelium. Unfortunately, the potential of A. oxalaticus strain HJ as biocontrol agent could not be assessed during the course of this thesis. However, preliminary results showed that S. sclerotiorum growth was slowed down in presence of vegetative cells of A. oxalaticus strain HJ. Still, much remains to be investigated to assess the potential of A. oxalaticus strain HJ as biocontrol agent against oxalogenic phytopathogenic fungi.
Notes
Thesis committee :
Prof. Pilar Junier, directrice de thèse, University of Neuchâtel
Dr Saskia Bindschedler, rapporteure, University of Neuchâtel
Prof. Daniel Croll, rapporteur, University of Neuchâtel
Prof. Laure Weisskopf, rapporteure, University of Fribourg
Defended on the 5th of June 2023
No de thèse : 3049
Prof. Pilar Junier, directrice de thèse, University of Neuchâtel
Dr Saskia Bindschedler, rapporteure, University of Neuchâtel
Prof. Daniel Croll, rapporteur, University of Neuchâtel
Prof. Laure Weisskopf, rapporteure, University of Fribourg
Defended on the 5th of June 2023
No de thèse : 3049
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Type de publication
doctoral thesis
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