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    Oxalotrophy as a biocontrol strategy. New insights in bacterial-fungal interactions
    (Neuchâtel : Université de Neuchâtel, 2023) ;
    Les champignons phytopathogènes représentent une menace importante pour les cultures et causent chaque année d’importantes pertes économiques. De plus, l’application intensive et systématique de fongicides contribue à la sélection de souches pathogènes résistantes aux antibiotiques. Afin d’assurer le futur de l’agriculture, il est donc nécessaire de développer des stratégies alternatives de lutte contre les pathogènes, telle que le biocontrôle. De nombreux champignons phytopathogènes utilisent les acides organiques à faible poids moléculaire, et en particulier l’acide oxalique, comme facteur de pathogénicité. L’acide oxalique est une molécule aux capacités très polyvalentes, qui est produite principalement par les plantes et les champignons. L’acide oxalique est ubiquiste dans la nature et de nombreuses bactéries, appelées les bactéries oxalotrophes, utilisent l’oxalate (la base conjuguée de l’acide oxalique) comme source de carbone et d’énergie. L’oxalotrophie bactérienne induit une forte alcalinisation et modifie ainsi les capacités physico-chimiques de l’environnement. L’oxalotrophie en tant que stratégie de biocontrôle s’est révélé être très efficace contre les champignons pathogènes oxalogéniques tel que Botrytis cinerea ou Sclerotinia sclerotiorum, deux champignons attaquant des cultures économiquement importantes. L’objectif de cette thèse était donc fournir de nouvelles connaissances sur les interactions bactérie-champignon dans le cas de l’oxalotrophie en tant que stratégie de biocontrôle. Pour ce faire, trois méthodes pour évaluer les interactions entre les spores ou les sclérotes fongiques et les cellules bactériennes ont été développées. Nous avons étudié le contrôle de la germination des spores de B. cinerea par deux bactéries oxalotrophes du sol, Cupriavidus necator et Cupriavidus oxalaticus, avec deux milieux différents, le milieu malt dilué et le milieu Reasoner’s 2. Le premier milieu favorise la croissance fongique, tandis que le second a été initialement développé pour la croissance bactérienne. La production d’acide oxalique et le contrôle de la croissance ont été évalués avec les deux milieux. Le contrôle de la croissance a été efficace seulement avec le milieu Reasoner’s 2 sur boîte (R2A) ou en liquide (R2B), le milieu dans lequel B. cinerea a produit de l’acide oxalique. L’acide oxalique n’a pas été détecté dans le milieu malt liquide (MB1/10). Les deux bactéries étaient capables de contrôler la croissance mycélienne, mais elles étaient incapables de contrôler la germination des spores de B. cinerea. Le biocontrôle a été attribué à la consommation d’acide oxalique, cependant, comme l’oxalotrophie impacte les propriétés physico-chimiques de l’environnement, la prochaine étape de cette étude a été de dissocier la consommation de l’acide oxalique et de l’impact du développement bactérien sur le pH. Afin de déterminer quel effet le changement de pH avait sur la germination et la croissance de S. sclerotiorum, la souche originale du champignon (WT) et une souche mutant incapable de produire de l’acide oxalique (Δoah) ont été confrontées à C. necator et C. oxalaticus sur les deux milieux mentionnés précédemment. Le contrôle de la croissance fongique n’était efficace qu’avec R2B, le milieu dans lequel S. sclerotiorum produisait de l’acide oxalique. S. sclerotiorum Δoah était aussi contrôlé par les bactéries oxalotrophes dans ce milieu, ce qui indiquait que la consommation de l’acide oxalique n’était pas le seul mécanisme derrière le contrôle du champignon. Des recherches supplémentaires ont montré que l’alcalinisation du milieu était responsable du contrôle de la croissance fongique. Durant les expériences de confrontation, des observations au microscope ont montré que C. necator et C. oxalaticus avec un comportement très différent envers le champignon en fonction du milieu de culture utilisé. Avec R2B, les bactéries étaient attirées par le champignon, tandis qu’avec MB1/10, elles étaient clairement repoussées par le mycélium. Des recherches plus poussées ont montré que les bactéries n’étaient pas attirées par le milieu de culture récupéré après la croissance de S. sclerotiorum dans R2B et que l’attraction semblait dépendre d’un métabolite associé au mycélium. Pour ce qui est du métabolite répulsif, nous avons montré qu’il se liait à la poly-l-lysine et qu’il avait des propriétés antibactériennes. Des expériences additionnelles restent à réaliser afin de déterminer la nature du métabolite et son potentiel contre d’autres bactéries à Gram-positif ou négatif. Finalement, des bactérie oxalotrophes sporulantes ont été isolées à partir d’un échantillon de sol afin de déterminer leur efficacité en tant qu’agent de biocontrôle. Plusieurs bactéries ont été isolées. Les isolats étaient identiques à plus de 99% et apparentés à Ammoniphilus oxalaticus, une bactérie sporulante strictement oxalotrophe. La souche isolée, A. oxalaticus strain HJ, était capable de germer et de pousser avec de l’oxalate de calcium (CaOx), de l’oxalate de potassium (KOx) et de l’acide oxalique. Cependant, cette bactérie ne pouvait compléter son cycle de vie (germination, croissance et sporulation) qu’avec CaOx. Afin de déterminer si les concentrations d’acide oxalique produites par B. cinerea et S. sclerotiorum étaient suffisantes pour supporter la croissance de la bactérie, les endospores d’A. oxalaticus strain HJ ont été inoculées en présence de mycélium des deux champignons. Les endospores d’A. oxalaticus strain HJ n’ont germé et poussé qu’en présence de S. sclerotiorum, et les cellules végétatives étaient très actives à proximité du mycélium. Malheureusement, il n’a pas été possible de déterminer le potentiel d’agent de biocontrôle de cette souche durant cette thèse. Les résultats préliminaires montrent que la croissance de S. sclerotiorum était ralentie en présence des cellules végétatives d’A. oxalaticus strain HJ, cependant, il reste encore beaucoup à faire avant de pouvoir déterminer le potentiel d’A. oxalaticus strain HJ en tant qu’agent de biocontrôle contre les champignons pathogènes oxalogènes. ABSTRACT Phytopathogenic fungi are a major threat to crops, and cause important economic losses every year. Furthermore, intensive and systematic fungicide application contributes to select resistant pathogenic strains and it is difficult to develop non-susceptible plant cultivars. In order to ensure the future of the agriculture, there is therefore a necessity to develop alternative pathogen control strategies, such as biocontrol. Many fungal phytopathogens use low molecular weight organic acids, and in particular oxalic acid, as a factor of pathogenicity. Oxalic acid is a highly versatile molecule mainly produced by plants and fungi, and ubiquitously found in nature. Numerous bacterial species can consume oxalate, the conjugated base of oxalic acid, as carbon and energy sources, and are thus called oxalotrophic bacteria. Bacterial oxalotrophy induces a strong alkalinisation locally, therefore modifying the physicochemical properties of the environment. Oxalotrophy as a biocontrol strategy has shown a great potential against oxalogenic phytopathogenic fungi such as Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum, two relevant pathogens for important crops. The aim of this thesis was therefore to provide new insights in bacterial-fungal interactions in the case of oxalotrophy as biocontrol strategy. For this purpose, three methods to assess the interactions occurring between fungal resting structures, such as spores or sclerotia, and bacterial cells were developed. We investigated the control of germination of B. cinerea spores by two oxalotrophic soil bacteria, Cupriavidus necator and Cupriavidus oxalaticus, with two different media, diluted malt medium and Reasoner’s 2 medium. The first medium favours fungal growth, while the second was originally developed for bacterial growth. Oxalic acid production by the fungus and growth control by the bacteria was assessed in both media. Mycelial growth control was only efficient in Reasoner’s 2 agar or broth (R2A; R2B), the medium in which B. cinerea produced oxalic acid. Conversly, no oxalic acid was detected in diluted malt broth (MB1/10) and both bacteriawere able to control the mycelial growth, but not the germination of B. cinerea spores. The control was attributed to the consumption of oxalic acid, however, as oxalotrophy impacts the physicochemical properties of the environment, the next step of this study was to disentangle oxalic acid consumption from the impact of bacterial development on pH. To determine the effect of the pH change on the germination and the mycelial growth of S. sclerotiorum, a wild type (WT) strain of the pathogen and a mutant deficient in oxalic acid production (Δoah) were confronted to C. necator and C.oxalaticus on the aforementioned media. Growth control was efficient only in R2B, the medium in which oxalic acid was produced by S. sclerotiorum WT. However, S. sclerotiorum Δoah was also controlled on this medium, indicating that oxalic acid consumption was not the only mechanism controlling fungal growth. Further investigations showed that media alkalinisation driven by oxalic acid consumption or additional aspects of bacterial metabolism was responsible for the fungal growth control. Observations by microscopy of the interactions occurring during biocontrol assays also showed that C. necator and C. oxalaticus had very different behaviours towards the fungal mycelium depending of the medium used. In R2B, bacteria were attracted to the fungus, while on MB1/10, they were clearly repulsed. Further experiments showed that the bacteria were not attracted by the spent medium of S. sclerotiorum cultures in R2B and that the attraction seemed to be dependant of a metabolite physically associated to the mycelium. For the repulsion, additional experiments showed that the repulsive metabolite had antibacterial properties and could be retrieved by selective binding to poly-l-lysine. Further studies are still required to determine the nature of the metabolite and its antibacterial potential against other Gram-positive and Gram-negative bacteria. Finally, oxalotrophic endospore-forming bacteria (EFB) were isolated from a soil sample in order to assess their efficiency as biocontrol agents. Several oxalotrophic EFB were isolated. All the isolates were identical at more than 99% based on 16S rRNA gene sequencing and were closely related to Ammoniphilus oxalaticus, an obligate oxalotrophic bacterium. The isolated strain, Ammoniphilus oxalaticus strain HJ, was able to germinate and grow with calcium-oxalate (CaOx), potassium-oxalate (KOx) or oxalic acid as carbon source. However, the bacterium was only able to complete its life cycle (germination, growth, and sporulation) with CaOx. The germination and growth of A. oxalaticus strain HJ spores was also assessed in presence of actively growing mycelium of B. cinerea and S. sclerotiorum, in order to determine if the concentration of oxalic acid produced by these two oxalogenic fungi was sufficient to support the growth of A. oxalaticus strain HJ. Endospore germination and growth of A. oxalaticus strain HJ was observed only in the presence of S. sclerotiorum. Vegetative cells were found to be very active in proximity of the mycelium. Unfortunately, the potential of A. oxalaticus strain HJ as biocontrol agent could not be assessed during the course of this thesis. However, preliminary results showed that S. sclerotiorum growth was slowed down in presence of vegetative cells of A. oxalaticus strain HJ. Still, much remains to be investigated to assess the potential of A. oxalaticus strain HJ as biocontrol agent against oxalogenic phytopathogenic fungi.
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    Characterization of the microbial community in raw milk cheese by high-throughput qPCR
    (Neuchâtel, 2022) ;
    Au cours des dernières décennies, les méthodes indépendantes de la culture ont été largement utilisées pour la recherche et le diagnostic en microbiologie alimentaire. Ces méthodes permettent une détermination rapide et précise de la composition microbienne d'une variété d'aliments. Récemment, la PCR quantitative (qPCR) et le séquençage de nouvelle génération (NGS), notamment le séquençage des amplicons du gène de l'ARNr 16S, ont été fréquemment utilisés pour étudier la composition microbienne du fromage et son influence sur la qualité du fromage. Cependant, ces méthodes sont relativement complexes et coûteuses pour une utilisation plus répandue, par exemple pour le contrôle de routine de la qualité du fromage dans les fromageries. Un avantage de la qPCR par rapport au NGS est la quantification des espèces bactériennes ciblées dans le fromage; cependant, il y a aussi un désavantage concernant le débit et la couverture de la population bactérienne. Il y a quelques années, le développement de nouvelles technologies dans le domaine de la microfluidique a permis d'augmenter le débit des systèmes qPCR, rendant possible la réalisation d'analyses qPCR sur un plus grand nombre d'échantillons et de tests avec un effort réduit. L'objectif de cette thèse était de développer les bases d'un système qPCR à haut débit (HT-qPCR) pour la quantification d'espèces bactériennes importantes pour la qualité des fromages au lait cru, qui serait applicable pour la recherche ainsi que pour le diagnostic des problèmes de qualité.
    Dans ce but, un pipeline automatisé pour la conception d'amorces qPCR spécifiques aux espèces a été développé et validé. Au total, 23 nouveaux systèmes d'amorces ont été conçus pour cibler les espèces bactériennes couramment utilisées dans les starters ou les bactéries lactiques non starters présentes dans les fromages au lait cru. La performance de ces systèmes d'amorces en combinaison avec le système HT-qPCR a été validée en utilisant des extraits d'ADN de cultures bactériennes pures et de fromages modèles inoculés. De plus, les performances de la HT-qPCR et du séquençage des amplicons du gène de l'ARNr 16S ont été comparées pour déterminer la composition microbienne de 21 fromages Raclette du Valais.
    Dans cette thèse, les concepts de base du développement d'un système HT-qPCR pour la quantification de certaines des espèces bactériennes les plus importantes pour la qualité du fromage ont été décrits. L'application et l'utilité de ce système pour la recherche microbiologique des aliments fermentés ont été démontrées. Une application potentielle de cette nouvelle approche serait l'étude du développement de la communauté bactérienne pendant la maturation. La poursuite du développement du système modulaire pourrait faciliter le dépistage rapide et économique des espèces bactériennes importantes pour la qualité des fromages avant et pendant la maturation, assurant ainsi un contrôle continu de la qualité pendant la fabrication des fromages au lait cru.
    Abstract In recent decades, culture-independent methods have been extensively used for research and diagnostics in food microbiology. These methods allow a rapid and accurate determination of the microbial composition in a variety of foods. Recently, quantitative PCR (qPCR) and next-generation sequencing (NGS), especially 16S rRNA gene amplicon sequencing, were frequently used to investigate the microbial composition of cheese and its influence on cheese quality. However, these methods are relatively complex and expensive for a more widespread use, for instance, for the routine monitoring of cheese quality in cheese dairies. An advantage of qPCR over NGS is the quantification of the targeted bacterial species in cheese; however, there is also a trade-off in throughput and the bacterial population coverage. A few years ago, the development of new technologies in microfluidics enabled higher throughput for qPCR systems, making it possible to perform qPCR analyses on larger numbers of samples and assays with reduced effort. The aim of this thesis was to develop the basis for a high-throughput qPCR (HT-qPCR) system for the quantification of quality-relevant bacterial species in raw milk cheese, which would be applicable for research as well as for the diagnosis of quality problems.
    For this purpose, an automated pipeline for the design of species-specific qPCR primers was developed and validated. In total, 23 new primer systems were designed targeting bacterial species commonly used in starters or present as part of the non-starter lactic acid bacteria in raw milk cheeses. The performance of these primer systems in combination with the HT-qPCR system were validated using DNA extracts from pure bacterial cultures and inoculated model cheeses. Further, the performance of HT-qPCR and 16S rRNA gene amplicon sequencing to determine the microbial composition of 21 Raclette du Valais cheeses was compared.
    In this thesis, the basic concepts of the development of a HT-qPCR system for the quantification of some of the most important bacterial species with relevance to cheese quality were described. The application and usefulness for microbiological research of fermented foods was demonstrated. A potential application of this novel approach is the study of the bacterial community development during ripening. Further development of the modular system could eventually facilitate the rapid and economical screening of quality-relevant bacterial species in cheeses before and during ripening, thus ensuring continuous quality control during the manufacture of raw milk cheeses.
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    Improving bio-inoculation for sustainable agriculture
    La pollution environnementale globale est l’une des plus grandes menaces pour les habitants de la planète. Parmi les différents types de problèmes environnementaux, la présente étude discute de questions liées à l’utilisation intensive des produits agrochimiques dans l’agriculture conventionnelle, en se focalisant sur la santé des plantes et sur les microorganismes du sol en tant que parties intégrantes des écosystèmes terrestres. En agriculture conventionnelle, des pratiques de gestion inadaptées et l’utilisation de produits agrochimiques ont un impact négatif à la fois sur le sol et sur la qualtié de l’eau. La recherche de solutions alternatives durables est ainsi devenue une priorité. Dans la mycorrhizosphère, les microorganismes sont impliqués dans de nombreux processus biologiques bénéfiques soutenant l’ensemble de l’écosystème sol, et sont ainsi considérés comme des acteurs cruciaux du fonctionnement des écosystèmes. Dans cette perspective, une évaluation in vitro des activités favorisant la croissance des plantes (PGP) chez différentes bactéries endosporulantes (EFB), ainsi que chez des champignons ayant différentes niches écologiques. Nous avons trouvé que la plupart des EFB testées possèdent des traits PGP. C’est également le cas des espèces de champignons testées. De plus, la confrontation entre ces bactéries et champignons a donné lieu à différentes interactions (antagonistes, neutres et positif). De manière intéressante, ces observations n’étaient pas uniquement dépendantes des microbes en concurrence, mais également du milieu de culture utilisé, soulignant l’importance du contexte nutritionnel dans les interactions microbiennes. A la suite de l’évaluation in vitro, l’effet PGP sur des plantes de trois différentes souches de Bacillus a été évalué. Différents schémas d’inoculation ont été comparés : chaque souche seule ou sous la forme d’un consortium des trois souches, ainsi que deux types de formes de vie, les cellules végétatives et les endospores. Ensuite, l’effet des bio-inoculants a été mesuré à différents niveaux de complexité, allant de conditions in vitro à un essai en champs. Cette approche par étape a permis de déterminer si des bio-inoculants plus complexes (en comparaison aux souches seules) étaient plus efficaces à stimuler la croissance des plantes, et quel était leur impact sur les communautés microbiennes autochtones. Les résultats obtenus ont démontré que les consortiums étaient plus constants dans la stimulation de la croissance des plantes que les souches seules, même au contact des microbes autochtones du sol. Fait important, les bactéries bio-inoculées n’ont pas affecté la structure des communautés bactériennes natives, comme démontré par l’utilisation de méthodes métagénomiques ciblant les communautés de champignons et de bactéries. Cette thèse a aussi mis en évidence les interactions microbiennes entre des membres de deux règnes, i.e. les bactéries et les champignons. Chacun d’eux joue un rôle crucial dans le fonctionnement des écosystèmes terrestres, et sont connus pour la diversité de leurs modes de nutritions. Cela peut conduire tant à des interactions positives, neutres ou négatives. Dans cette thèse, une interaction antagoniste, c’est à dire le mode de vie mycophage des bactéries, a été étudiée en détail. Lors de la mycophagie, les bactéries obtiennent des nutriments directement d’un champignon vivant, exerçant un impact négatif sur ce partenaire fongique. Les découvertes de ce travail suggèrent que la bactérie Lysinibacillus sphaericus 1003 a un mode de vie mycophage préférentiel vis-à-vis du champignon phytopathogène Rhizoctonia solani, alors qu’il ne nuit pas au champignon saprophyte Trichoderma rossicum. La bactérie peut croître aux dépends du mycélium de R. solani et, plus important, elle a un impact négatif sur la biomasse fongique. Au contraire, et malgré que L. sphaericus 1003 croisse aux dépends de T. rossicum, la bactérie a un impact positif sur la biomasse de T. rossicum. Par conséquent, ce comportement différent vis-à-vis d’un pathogène de plante (R. solani) et d’un champignon bénéfique à la plante (T. rossicum) peut constituer un modèle intéressant pour mieux comprendre le rôle de la mycophagie dans le cycle du carbone dans les sols. Globalement, cette étude apporte de nouvelles connaissances et réflexions au domaine de l’agriculture durable puisqu’elle combine différentes approches de bio-inoculation. Finalement, cette étude contient de nouveaux éléments de discussions proposant des voies pour le développement futur de la stimulation de la croissance des plantes et le biocontrôle par l’utilisation de micro-organismes. ABSTRACT Global environmental pollution is one of the greatest threats to the inhabitants of planet Earth. Among the different types of environmental problems, the present study discusses issues related to the extensive utilization of agrochemicals in conventional agriculture by focusing on plant health and soil microbes as integral parts of terrestrial ecosystems. In conventional agriculture, inappropriate management practices and the use of agrochemicals have led to a negative impact on both soil and water. As a result, the search for sustainable alternatives in agriculture has become a priority. In the mycorrhizosphere, microbes are involved in many beneficial activities supporting the whole soil ecosystem and thus are considered as crucial actors of soil functioning. With such a perspective, an in vitro screening was carried out to evaluate the plant growth promoting (PGP) activities of different endospore forming bacteria (EFB), as well as of fungi with different ecological niches. We found that most of the screened EFB possessed one or more PGP traits. The fungal species that were screened were also positive for PGP traits. Moreover, confrontation of these bacteria and fungi resulted in many different interactions (antagonistic, neutral or positive). Interestingly, these findings did not only depend on the competing microbes, but also on the medium used, pointing at the importance of the nutritional context in microbial interactions. After the in vitro screening, the PGP effect of three different Bacillus strains was assessed in planta. Different bacterial inoculation schemes were compared: each strain alone or the three as a consortium and both life forms, vegetative cells and endospores, were compared. Then, the effect of the bio-inoculants was measured at different levels of complexity, from in vitro conditions to a field trial. This step-wise approach allowed deciphering whether more complex bio-inoculants (as compared to single strains) were more effective in promoting plant growth and whether this had any impact on the autochthonous microbial communities. The results obtained demonstrated that bacterial consortia were more consistent in promoting plant growth than single strains, even when in contact with the autochthonous soil microbes. Importantly, the bio-inoculated bacteria did not affect the structure of the native microbial communities, as demonstrated by using targeted metagenomics on both fungal and bacterial communities. This thesis also highlighted microbial interactions between members belonging to two kingdoms, i.e. bacteria and fungi. Both of them play crucial roles in terrestrial ecosystem functioning and are known for their diversified nutritional capabilities. This can lead to all type of interactions, from positive to negative ones. In this thesis, one antagonistic interaction, the mycophageous life-style of bacteria was investigated in detail. In mycophagy, bacteria obtain nutrients from living fungi and exert a negative impact on the fungal partner. The findings of this work suggest that the bacterium Lysinibacillus sphaericus 1003 has a preferential mycophagous lifestyle towards the phytopathogenic fungus Rhizoctonia solani, while it does not harm the saprophytic Trichoderma rossicum. The bacterium can grow at the expense of the living mycelium of R. solani and, more importantly, has a negative impact on fungal biomass. In contrast, and even though L. sphaericus 1003 grew at the expense of T. rossicum, the bacterium has a positive effect on T. rossicum biomass. Therefore, this differential behavior towards a plant pathogen and a plant beneficial fungus could constitute an interesting model to better understand the role of mycophagy in soil carbon cycling. Overall, this study brings novel insights in the frame of a sustainable exploitation of agricultural ecosystems by combining different types of bio-inoculation methods. Moreover, aspects related to future developments required in the field of plant growth promotion and biocontrol are discussed at the end of this study.
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    Bacterial iron reduction and biogenic mineral formation for the stabilization of corroded iron objects
    En raison de la réactivité du fer à certains composés (oxygène, eau, chlore), ce métal pourrait être facilement corrodé et endommagé. De nombreux domaines tels que l'industrie alimentaire ou l'approvisionnement en eau rencontrent de graves problèmes dus à la corrosion du fer. La corrosion du fer engendre ainsi des pertes économiques importantes. Cela concerne aussi le patrimoine culturel où les objets en fer et surtout les objets archéologiques souffrent également de la corrosion et peuvent être détruits de façon irréversible. Afin de remédier à ces problèmes de corrosion, différentes méthodes conventionnelles de conservation-restauration existent. Cependant, ces techniques présentent certains inconvénients ou ne sont pas totalement efficaces en termes d’inhibition de la corrosion ou de déchloruration des objets. De nos jours, l'utilisation de la biotechnologie représente une approche prometteuse. En effet, il y a un intérêt croissant pour la synthèse de composés inorganiques par des systèmes biologiques dans des processus qui sont respectueux de l’environnement et des personnes. L'utilisation de micro-organismes ayant la capacité de transformer des produits de corrosion réactifs en composés chimiquement stables et insolubles avec un volume molaire inférieur représente une approche alternative aux méthodes traditionnelles utilisées dans le domaine de la conservation du fer. L'objectif global de cette étude est de contribuer au développement d'une approche biotechnologique pour la conservation-restauration des éléments en fer corrodés (monuments extérieurs et objets archéologiques). Pour cela, la réduction du fer par les bactéries a été choisie comme processus métabolique sous-jacent à la transformation des produits de corrosion réactifs (principalement akaganeite et lépidocrocite présents sur les objets en fer corrodés) en minéraux de Fe(II) (tels que magnétite et sidérite). L'hypothèse testée considère qu'en utilisant des bactéries réductrices du fer, des minéraux Fe(II) biogéniques seront formés permettant la conversion des produits de corrosion présents sur les objets, et qu’ainsi les objets en fer seront stabilisés et empêchés de corrosion ultérieure. Deux principales stratégies ont été étudiées au cours de ce projet. La première approche étant l'utilisation de Shewanella loihica comme modèle de bactérie réductrice du fer, notamment car elle est également connue pour être anaérobe facultative, halophile et a été utilisée pour la production de minéraux de Fe(II) dans d'autres études. Au cours de ce projet de doctorat, des résultats additionnels intéressants ont été obtenus : la réduction du fer avec S. loihica n'était possible qu'en présence de NaCl et des phosphates de Fe(II) inattendus se sont formés. La pertinence du processus de stabilisation proposé a donc été démontrée et complétée par l'étude du rôle du sel dans la réduction du fer et de l'accumulation de polyphosphates dans cet organisme. La deuxième approche consistait à isoler à partir d'échantillons environnementaux d’autres candidats bactériens réduisant le fer. L’échantillonnage a abouti à la sélection de deux de deux souches du genre Aeromonas. Les deux souches isolées ont été alors employées dans la démonstration expérimentale du processus de réduction du fer sur des objets archéologiques une avec ces deux bactéries sélectionnées permettant la mise en place d'un prototype de traitement applicable par les conservateurs-restaurateurs. ABSTRACT Due to the reactivity of iron to some compounds (oxygen, water, chlorine), this metal could be easily corroded and thus endangered. Many fields like food industry or water supply encounter severe problems due to iron corrosion that engenders important economic losses. In cultural heritage, iron artifacts and especially archaeological iron objects suffer from corrosion and could be irreversibly damaged. In order to remediate to these issues, different conventional conservation-restoration methods exist. However, these techniques present some caveats and/or are not completely efficient in terms of chlorine removal or corrosion inhibition. Nowadays, the use of biotechnology represents a promising approach. Indeed, there is a growing interest in the synthesis of inorganic components by biological systems in processes that are respectful of the environment. The use of microorganisms with the ability to transform reactive corrosion products into chemically stable and insoluble compounds with a lower molar volume represents an alternative approach to the traditional methods employed in the field of iron conservation. The overall aim of this study is to contribute to the development of a biotechnological approach for the conservation-restoration of corroded iron items (outdoor monuments and archaeological objects). For this purpose, iron reduction by bacteria was selected as an interesting metabolic process underlying the transformation of Fe(III) corrosion products (such as akageneite and lepidocrocite present in corroded iron objects) into Fe(II) minerals (such as magnetite and siderite). The hypothesis tested considers that using iron-reducing bacteria, biologically-induced Fe(II) minerals will be formed from the corrosion products present on the objects and thus these latter will be stabilized and protected further corrosion. Two main strategies were considered during this project. The first approach was the study of a known bacterium Shewanella loihica as a model iron reducer given that it is known to be a facultative anaerobe, halophilic and was used for the production of Fe(II) minerals in other studies. During this PhD project, interesting additional results were obtained: the iron reduction with S. loihica was solely possible in presence of NaCl and unexpected Fe(II) phosphate minerals were formed. The suitability of the proposed stabilization process was hence demonstrated and complemented with the investigation of the role of salt on iron reduction and of the accumulation of polyphosphates in this micro-organism. The second approach was the isolation of iron-reducing bacterial candidates from environmental samples. The screening resulted in the selection of two strains from the genus Aeromonas. Both isolated strains were employed in the experimental testing of the iron reduction process on archaeological objects allowing the setting-up of a prototype treatment that can be applied by conservator-restorers.
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    Fungal biogenic patina: optimization of an innovative conservation treatment for copper-based artefacts
    (2017)
    Albini, Monica
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    Les micro-organismes sont souvent considérés dangereux pour les biens culturels. Malgré cela, ils peuvent aussi être utilisés pour leur protection. En effet, certaines espèces fongiques sont connues pour leur capacité à produire de l'acide oxalique pour immobiliser des métaux lourds toxiques et, donc, détoxifier leur milieu. La biotechnologie a déjà exploité cette capacité d'immobiliser des métaux lourds sous forme d’oxalates métalliques dans le domaine du traitement des déchets. Le projet « biopatine » a tiré profit cette capacité pour modifier des produits de corrosion de cuivre actifs en des composés plus stables et moins solubles comme les oxalates de cuivre. La présence des oxalates de cuivre a été déjà observée sous forme de patines vertes sur des œuvres d’art en bronze à l’extérieur et ils n'ont pas été associés à de la corrosion cyclique. En outre, les oxalates de cuivre sont connus pour être extrêmement stables dans des atmosphères polluées en conditions acides (pH 3), fournissant une bonne protection aux sculptures à base de cuivre. Le projet « biopatine » a comme objectif la production de’ oxalates de cuivre comme composés passivant ayant la même composition que des minéraux de cuivre naturellement présents sur le patrimoine cuivreux (matériaux inorganiques) et l'amélioration de la compatibilité entre le traitement e la surface corrodée. Lors de projets précédents (FP6-EU-ARTECH, 2004-2009 et FP7-BAHAMAS, 2010-2012), l'espèce fongique la plus appropriée a été identifiée et des tentatives de production d’oxalates de cuivre ont été effectuées avec succès. L’objectif de cette thèse était d’optimiser le nouveau traitement biologique développé pour la conservation d’œuvres d’art en cuivre afin de transférer les tests de laboratoire à une mise ne pratique sur le terrain. Ce travail de thèse s'est concentré sur deux sujets principaux : l'étude du micro-organisme utilisé pour la production des oxalates de cuivre biogéniques et les matériaux traités, notamment cuivre et bronze. En ce qui concerne les matériaux traités, le but était de comprendre quels mécanismes protecteurs sont impliqués dans le traitement biopatine permettant de déterminer si ce traitement agit comme un inhibiteur de corrosion ou comme un coating. Le traitement biologique a été comparé à des traitements de conservation standards, la cire microcristalline comme coating et le benzotriazole comme inhibiteur de corrosion, et son comportement à long terme a été évalué par des procédures de vieillissement naturel et artificiel. En outre, l'influence des éléments de l’alliage, l’étain en particulier, sur le comportement du traitement biopatine a été examinée. Pour ce faire, un complément de techniques analytiques a été utilisé: chromatographie liquide à haute performance (HPLC), microscopie optique (OM), microscopie électronique à balayage (SEM) couplé avec spectroscopie à rayons X à dispersion d'énergie (EDS), spectroscopie infrarouge (FTIR), spectroscopie Raman, Spectroscopie d'Impédance Electrochimique (EIS) et colorimétrie. Les résultats de ce travail ont montré que le traitement biopatine se place parmi les inhibiteurs de corrosion plutôt que les revêtements. Le traitement biopatine peut aussi être utilisé pour remplacer le benzotriazole (BTA) comme traitement sans risques pour la santé et l’environnement et plus efficace pour la stabilisation des objets archéologiques. Il peut aussi être appliqué sur des objets en extérieur et son efficacité n'est pas influencée par la composition de l’alliage. En outre, le protocole d'application actuellement utilisé sur des artefacts réels a été développé. Finalement, basé sur les résultats de cette étude, un kit prêt à l'emploi est actuellement en évaluation pour une commercialisation et est mis à disposition des x conservateurs-restaurateurs., Microorganisms are often considered harmful for cultural heritage. However, they can also be used for its safeguarding. Indeed, some fungal species are known for their ability to produce oxalic acid in order to immobilize of toxic heavy metals and, therefore, detoxify their environmental. Biotechnology already exploited this ability to immobilize heavy metals in the field of waste treatment forming metal oxalates. The “biopatina project” used this ability in order to modify active copper corrosion products into more stable and less soluble compounds such as copper oxalates. The presence of copper oxalates as green patinas was already discovered on outdoor bronze artefacts and it was not associated with active corrosion. Furthermore, copper oxalates are known to be extremely stable in polluted atmospheres with acidic conditions (pH 3), providing good protection to copper-based artefacts. The “biopatina project” aims to produce copper oxalates as passivating compound having the same composition as naturally occurring copper minerals (inorganic materials) enhancing the compatibility of this treatment with the corroded surface of artefacts. During previous projects (FP6-EU-ARTECH, 2004-2009 and FP7-BAHAMAS, 2010-2012), the most suitable fungal specie to be used was identified and initial successful attempts to produce copper oxalates were performed. The aim of this thesis was to optimise this novel biological treatment for the conservation copper-based artefact in order to transfer it from the laboratory tests to real-praxis. This work focused on two main subjects: the study of the microorganism used for the production of biogenic copper oxalates and the treated material, namely copper and bronze. Regarding the treated material, the aim was to understand which protective mechanisms are involved in the biopatina treatment allowing to understand if such treatment acts as a corrosion inhibitor or as a coating. The biological treatment was compared to standard conservation treatment as microcrystalline wax (coating system) and benzotriazole (corrosion inhibitor) and its long-term behaviour was tested by natural and artificial ageing. Furthermore, the influence of alloying elements, particularly tin, on the behaviour of biopatina treatment was investigated. To do that, a complement of analytical techniques was used: high-performance liquid chromatography (HPLC), optical microscopy (OM), scanning electron microscopy (SEM) coupled with energy dispersive spectroscopy (EDS), infrared spectroscopy (FTIR), Raman spectroscopy, electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and colorimetry. The outcomes of this work showed that the biopatina treatment is positioned in the range of corrosion inhibitors rather than protective coatings. Biopatina treatment can be used to replace benzotriazole (BTA) solutions as innocuous and more efficient treatment for archaeological objects. It can also be applied on outdoor objects, regardless the geometry of exposure conditions and its efficiency is not influenced by the bronze composition. Furthermore, the application protocol currently used on real artefacts was developed. Finally, based on the outcome of this study, a ready-to-use kit is currently under evaluation for commercialization and available for small trials to conservators-restorers.
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    Highways and subways: a story of fungi and bacteria in soils
    (2016)
    Simon, Anaële
    ;
    ;
    Verrecchia, Eric P.
    Traditionnellement, bactériologues et mycologues mènent leurs recherches séparément, et ce malgré le fait que bactéries et champignons coexistent dans pratiquement tous les écosystèmes. Parmi les nombreuses interactions qui peuvent avoir lieu entre champignons et bactéries, cette thèse étudie les autoroutes fongiques, une interaction dans laquelle les bactéries sont capables de se déplacer le long d’hyphes de champignons. Nous avons investigué différents sols, avec une attention particulière portée à la voie oxalate-carbonate. Dans cette voie métabolique, il semblerait que la dispersion de bactéries le long d’hyphes fongiques soit importante pour l’activité oxalotrophe des bactéries. Nous avons développé un nouvel outil, appelé colonne pour autoroutes fongiques, destiné à isoler spécifiquement des champignons et des bactéries capables de se déplacer le long d’hyphes fongiques. Une approche à la fois cultivable et moléculaire nous a permis d’avoir un aperçu de la diversité des champignons et des bactéries interagissant par autoroutes fongiques dans les sols. Nos résultats suggèrent que la migration de bactéries le long des hyphes peut être soit extra-hyphale (autoroutes fongiques), soit intra-hyphale (métros fongiques). Nous avons observé que le déplacement de bactéries le long des hyphes fongiques est dépendant du milieu de culture, mais nous n’avons pas pu trouver l’élément régissant ce comportement différentiel. Nos résultats montrent que les autoroutes - et métros - fongiques doivent être considérés comme cruciaux pour la colonisation de nouveaux environnements par les bactéries. De plus, ces interactions jouent un rôle important dans la structuration des communautés bactériennes dans les sols. Nous avons également démontré que des champignons présents dans la voie oxalate-carbonate sont capables de dissoudre l’oxalate de calcium, ainsi que de disperser des bactéries non-oxalotrophes, redéfinissant ainsi le rôle de chaque organisme dans la voie oxalate-carbonate. Finalement, nous avons observé une propriété surprenante de certains champignons, que l’on pourrait relier a de la fixation d’azote, mais nous n’avons pu ni prouver, ni démentir, cette capacité. Cette thèse permet d’entrevoir la complexité des interactions champignons-bactéries, et démontre qu’il est important de considérer les deux groupes d’organismes lors d’études de leur écologie dans les sols., Traditionally, bacteriologists and mycologists have conducted study of their respective fields separately, despite of the fact that bacteria and fungi co-exist in almost every type of ecosystem. Amongst the numerous types of interactions possibly occurring between fungi and bacteria, this thesis focuses on fungal highways, a mechanism by which bacteria disperse along fungal hyphae. We investigated various soils, with special focus on soils under the influence of the oxalate-carbonate pathway. In this pathway, fungal-driven bacterial dispersal seems to be relevant for bacterial oxalotrophic activity. We developed and validated a device called fungal highway column, intended for the targeted isolation of fungi and bacteria migrating along fungal hyphae. Culture-based and culture-independent approaches allowed for an insight into the diversity of fungi and bacteria able to interact via fungal highways in soils. Our findings propose that migration of bacteria along hyphae might be either extrahyphal (fungal highways) or intrahyphal (fungal subways). We observed that bacterial migration along fungal hyphae is dependent on the culture medium, but we could not determine the element(s) triggering this differential behavior. Our results show that fungal highways (and subways) should be considered as crucial for the colonization of novel environments by bacteria, and that they play an important role in the structuring of bacterial communities in soils. As well, we demonstrated that fungi present in the oxalate-carbonate pathway are able to dissolve calcium oxalate and to disperse non-oxalotrophic bacteria, thus redefining the role of the microbial components in this pathway. Finally, we observed surprising properties of fungi, resembling to nitrogen fixation, but we could neither prove nor disprove this ability. This thesis gives an insight into the complexity of fungal-bacterial interactions, and demonstrates the importance of considering both groups of organisms for the study of their ecology in soils.
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    Sporulation capability and metabolic mechanisms of endospore-forming Firmicutes under conditions limiting for growth and survival
    (2016)
    Filippidou, Sevasti,
    ;
    La vie, telle que nous la connaissons, possède des limites physiques et chimiques. Plus précisément, des paramètres environnementaux physiques et chimiques limitent la reproduction, le métabolisme et la survie des organismes vivants décrits à ce jour. Des conditions environnementales défavorables à la survie et au développement biologique sont la règle plutôt que l'exception dans la plupart des habitats. Les microorganismes ont cependant développé différentes stratégies pour résister aux conditions environnementales qui limitent leur croissance. Parmi ces microorganismes, le groupe des Firmicutes endosporulantes présente de nombreuses stratégies pour résister à ces contraintes environnementales, allant de l'état de dormance (endospore), à la formation de biomembranes en passant par l'adaptation métabolique. Ces stratégies sont un investissement biologique coûteux pour les organismes et par conséquent, peuvent influencer leur succès.
    Les Firmicutes endosporulantes ont été isolées dans des environnements variés, y compris dans des habitats extrêmes. Paradoxalement, dans les études de diversité elles sont, soit absentes de ces environnements, soit elles représentent une faible fraction de la communauté microbienne. A l'aide d'une analyse de profil du gène spo0A, un gène spécifique des Firmicutes endosporulantes, nous avons montré que ces dernières ne pouvaient pas être détectées dans les métagénomes publiques disponibles, et ce malgré le fait que plusieurs de ces métagénomes étaient issus d'habitats connus pour abriter des Firmicutes endosporulantes. Nous avons mis en évidence que ce biais était dû au fait que les approches méthodologiques couramment utilisées étaient inefficaces. De plus, nous avons démontré expérimentalement qu'une extraction d'ADN optimisée permettait d'améliorer la détection de Firmicutes endosporulantes par séquençage d'amplicon. Cependant ce n'était pas le cas pour le séquençage shotgun. Bien que ce groupe bactérien soit connu pour sa capacité à coloniser tous les habitats sur Terre, les Firmicutes endosporulantes ne sont pas fréquemment retrouvées dans tous les habitats. Leurs stratégies de survie étant énergétiquement coûteuses, elles ne deviennent un avantage uniquement lorsque plusieurs contraintes physiques et chimiques sont présentes. Les conditions extrêmes favorisent la présence des stratégies de survie déployées par les Firmicutes endosporulantes.
    Plus spécifiquement, nous avons démontré que des conditions environnementales extrêmes étaient un facteur important pour l'apparition de la sporulation comme stratégie de survie. Deux nouvelles découvertes supportent cette hypothèse. Premièrement, nous avons montré que les conditions extrêmes étaient une force motrice de la sporulation pour une espèce qui n'était pas connue pour sporuler, Serratia ureilytica. Deuxièmement, nous avons démontré que la capacité de sporuler n'était pas perdue lorsqu'il y avait une pression environnementale. C'était le cas de Kurthia spp., un genre décrit jusqu'à présent comme asporogénique. L'ancêtre commun de Kurthia, une Firmicutes endosporulante, était capable de produire des spores, cependant cette capacité était considérée comme perdue dans la lignée de Kurthia. L'analyse génomique ainsi que des observations microscopiques d'une souche de Kurthia sp. isolée d'un réservoir géothermique ont révélé que la voie de sporulation n'avait pas été perdue et que Kurthia n'est pas un genre asporogénique mais un genre cryptosporulant.
    La stratégie de survie de sporulation rend les Firmicutes endosporulantes capables de tolérer des conditions défavorables et de prospérer dans des environnements extrêmes. Une nouvelle espèce, Anoxybacillus geothermalis, a été découverte dans une niche écologique particulière, les réservoirs géothermiques. Cette souche a été remise en culture au laboratoire et nous avons émis l'hypothèse que cette souche était inactive dans le réservoir depuis le Permien. D'autres isolats appartenant à la même espèce ont également été découverts dans différents réservoirs géothermiques. Les environnements extrêmes permettent aux Firmicutes endosporulantes d'utiliser leur stratégie de sporulation mais également de tirer profit de leur grande diversité métabolique. L'analyse des processus d'oxydation du manganèse et de réduction du cuivre par les Firmicutes endosporulantes dans des environnements naturels et non contaminés a révélé que la tolérance aux métaux est un phénomène largement répandu dans les environnements non contaminés, y compris parmi des Firmicutes endosporulantes aérobies ne présentant pas de lien de parenté. Enfin, dans les milieux salins, ces deux stratégies de survie sont utilisées et génèrent une impressionnante diversité de Firmicutes endosporulantes.
    En conclusion, l'utilisation de données biochimiques, génomiques, écologiques et environnementales a permis de mieux comprendre l'adaptation des Firmicutes endosporulantes aux environnements extrêmes., Life, as we know it, has physical and chemical limits. More precisely, physical and chemical environmental parameters set the thresholds for reproduction, metabolism and survival for the organisms known to date. Environmental conditions unsuitable for survival and development are the rule rather than the exception in most habitats. Microorganisms have developed various strategies to withstand environmental conditions that limit active growth. A microbial group that displays a large array of strategies to resist adversity is endospore‐forming Firmicutes. These strategies range from the formation of resting states (endospores), to biofilms and metabolic adaptation. These strategies are a costly biological investment and therefore might affect their success.
    Endospore-forming Firmicutes have been isolated from various environments, including extreme habitats. Paradoxically, in diversity studies they are either absent from these environments or they represent a small fraction of the microbial community. Using a profile analysis of the spo0A gene, unique to endospore‐forming Firmicutes, we have shown that they cannot be found in publically available metagenomic datasets, despite the fact that many of these datasets correspond to well-known habitats for endospore‐forming Firmicutes. We have shown that this bias is likely due to the fact that commonly used methodological approaches are inefficient. Moreover, we have shown experimentally that an improved DNA extraction can improve detection in amplicon sequencing; however, this was not the case for shotgun classification. Although this group is known to colonize every habitat on Earth, endospore-firming Firmicutes are not prevalent in all habitats. Their energy-demanding survival strategies become an actual benefit only when multiple physical and chemical limits of life are present. Extremity favors the presence of the survival strategies deployed by endospore-forming Firmicutes.
    More specifically, we have shown that extreme environmental conditions are an important factor for the survival strategy of sporulation to evolve. Two novel discoveries support this suggestion. Firstly, we have shown that extremity is a driving force for sporulation in a species that was not known to sporulate, Serratia ureilytica. Secondly, we demonstrated that the ability to sporulate is not lost when there is environmental pressure. That was the case of Kurthia spp. a previously known asporogenic genus. The common ancestor of Kurthia, and the endospore-forming Firmicutes was able to produce spores, however sporulation is considered to have been lost within the lineage of Kurthia. The genomic analysis and the microscopic observation of a Kurthia sp. strain isolated from a geothermal reservoir reveal that the sporulation pathway has not been lost, and that Kurthia is not an asporogenic but rather a cryptosporulating genus.
    The survival strategy of sporulation makes endospore-forming Firmicutes capable of tolerating adverse conditions and thriving in extreme environments. A novel species that has a particular ecological niche in geothermal reservoirs was discovered; Anoxybacillus geothermalis was revived under laboratory conditions and is hypothesized to have remained inactive in the reservoir since the Permian age. More isolates belonging to the same species were also discovered in different geothermal reservoirs.
    Extreme environments do not only allow endospore-forming Firmicutes to deploy their sporulation strategy but also their high metabolic diversity. Manganese oxidation and copper reduction of endospore‐forming Firmicutes in natural, uncontaminated environments, were studied leading to the conclusion that metal tolerance is a widespread phenomenon in unrelated aerobic endospore‐forming Firmicutes from natural uncontaminated environments. Finally, in saline habitats, both metabolic strategies are deployed, resulting in an impressive diversity of endospore‐forming Firmicutes. Biochemical, genomic, ecological and environmental data are pieces to fill in the puzzle of adaptations of endospore-forming Firmicutes in extreme habitats.
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    Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells
    Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
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    Exploiting the fungal highway: development of a novel tool for the in situ isolation of bacteria migrating along fungal mycelium
    (2015) ; ; ;
    Wick, Lukas Y.
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    Kooli, Wafa M.
    ;
    Verrecchia, Eric P.
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    Fungi and bacteria form various associations that are central to numerous environmental processes. In the so-called fungal highway, bacteria disperse along fungal mycelium. We developed a novel tool for the in situ isolation of bacteria moving along fungal hyphae as well as for the recovery of fungi potentially involved in dispersal, both of which are attracted towards a target culture medium. We present the validation and the results of the first in situ test. Couples of fungi and bacteria were isolated from soil. Amongst the enriched organisms, we identified several species of fast-growing fungi (Fusarium sp. and Chaetomium sp.), as well as various potentially associated bacterial groups, including Variovorax soli, Olivibacter soli, Acinetobacter calcoaceticus, and several species of the genera Stenotrophomonas, Achromobacter and Ochrobactrum. Migration of bacteria along fungal hyphae across a discontinuous medium was confirmed in most of the cases. Although the majority of the bacteria for which migration was confirmed were also positive for flagellar motility, not all motile bacteria dispersed using their potential fungal partner. In addition, the importance of hydrophobicity of the fungal mycelial surface was confirmed. Future applications of the columns include targeting different types of microorganisms and their interactions, either by enrichment or by state of the art molecular biological methods.
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    Assessing the role of native plant growth-promoting Rhizobacteria as bio-inoculants for Yerba Mate ("Ilex paraguariensis")
    (2015)
    Bergottini, Veronica M
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    The accelerated process of soil degradation due to long-term inadequate agricultural practices in Misiones, the major productive region of Yerba Mate (Ilex paraguariensis St. Hill.) in Argentina, has led to an urgent need for research and development of more sustainable agricultural practices. Yerba Mate is an emblematic crop in southern South America due to its leaves are used to prepare an energizing beverage called “mate” consumed as an alternative to coffee. The main goal of this study was to evaluate the role of native plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) as potential bio-inoculants for Yerba Mate seedlings.
    This thesis has shown that biomass yields of Yerba Mate seedlings can be increased up to 183% through bio-inoculation with native PGPR strains. Interestingly, the biomass yield increase was obtained through bio-inoculation in a less fertile soil. Kosakonia radicincitans YD4 was the most effective PGPR strain in enhancing the growth of Yerba Mate seedlings. Bio-inoculation with this strain in soil led to higher yields than those obtained in compost, even though higher yields can be expected in the latter due its high fertility. These results suggested that this strain represents a promising candidate to evaluate its potential as bio-inoculant for this crop in low-productive plantations.
    The whole genome of K. radicincitans YD4 was sequenced and annotated to analyze the genetic potential ability to colonize the rhizosphere, and if virulence-associated genes are present in this strain. The presence of genes for chemotaxis, adherence structures (fimbriae) and anti-microbial activities reflected the genetic potential of this strain to colonize and compete successfully in the rhizosphere. Regarding the safety of using YD4 as a bio-inoculant, two gene clusters (Type III and Type VI secretions systems) often associated to pathogenicity were identified. Comparative genomic analysis using closely related pathogenic and PGPR strains suggested that these gene clusters might confer adaptative advantages to YD4 to compete against other microbes and survive in the rhizosphere. This hypothesis has been also proposed for other beneficial plant associated bacteria possessing these gene clusters.
    In order to evaluate the ability of the bio-inoculant YD4 to colonize the rhizosphere of Yerba Mate seedlings, a strain-specific real time PCR approach was designed. The dynamics of YD4 was monitored in the rhizosphere of inoculated seedlings during five weeks in nursery. The plant growth-promoting effect of YD4 was confirmed by higher biomass yields and the introduced strain was detected in the rhizospheric soil until the end of the experiment (five weeks). These results suggested that the strain YD4 once inoculated, colonize and remain associated to the rhizosphere exerting its plant growth-promoting effect. Combining these results we can confirm that the isolate YD4 is a PGPR strain with a promising potential to be used as a bio-inoculant for Yerba Mate seedlings.
    In the last chapter, the bacterial and fungal root-associated microbiome of Yerba Mate was analyzed for the first time using a pyrosequencing approach. This study aimed at the description of the enriched microbial taxa potentially involved in plant growth promotion inhabiting the roots of this crop. In addition, we analyzed if the agricultural historical management and location sites of Yerba Mate plantations have an effect on the alpha and beta diversity. Our results have shown that the bacterial genera Burkholderia and Enterobacter (containing well-known PGPR representatives) were enriched in Yerba Mate roots, whereas endomycorrhizal fungi were enriched particularly in one low-productive plantation with low soil P content. Yerba Mate trees might be exerting a selective pressure for mycorrhization in this type of plantations. The bacterial community composition, genetic diversity and phylogenetic diversity were significantly influenced by the geographical location of the plantations; whereas the fungal community composition and genetic diversity were significantly affected by the geographical location and soil pH. No effect of the historical agricultural management or location of the plantations was observed on the alpha diversity.
    This thesis has contributed with an eco-friendly strategy to improve Yerba Mate growth in nursery, and highlighted the fact that better yields can be obtained thought bio-inoculation in less fertile soils. We are optimistic that this strategy could be exploited in field conditions in the future.