Options
Investigations of candidate plastoglobule proteins: characterization of chloroplast NON-INTRINSIC ABC PROTEINS 13 and -14 in "Arabidopsis thaliana" & Constitutive expression of CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 4 leads to a reduced level of photosynthesis-related carotenoids during senescence
Auteur(s)
Rottet, Sarah
Editeur(s)
Date de parution
2016
Mots-clés
Résumé
La photosynthèse est le processus clé se déroulant au sein du chloroplaste. La machinerie photosynthétique est intégrée à une matrice très dynamique, la membrane des thylakoïdes. Les galactolipides, les principaux lipides polaires de cette membrane, lui confèrent la propriété de bicouche alors que les lipides neutres tels que les prényllipides et les caroténoïdes contribuent à d’essentielles fonctions telles que le transport d’électrons et la photoprotection. Malgré de nombreuses études, la biogénèse et la dynamique des thylakoïdes restent irrésolus. Les plastoglobules (PG), des gouttelettes lipidiques associées aux thylakoïdes, participent activement aux fonctions des thylakoïdes. Sous un environnement changeant et lors des différents stades de développement, le recrutement d’enzymes spécifiques permet aux PG de participer à la synthèse, la réparation et l’élimination des métabolites. Dans le premier chapitre de cette thèse, nous passons en revue les PG en tant que microdomaines des thylakoïdes et discutons leur implication dans le remodelage lipidique lors de stress et lors de la conversion d’un type de plaste à l’autre. <br> Le chapitre II est dédié à la caractérisation de NAP13 (ABCI10) et -14 (ABCI11). Ces deux protéines appartiennent à la grande famille des ABC. Chaque membre de la sous-famille ABCI présente un seul des domaines typiques des transporteurs ABC. <i>NAP13</i> et <i>-14</i> codent deux domaines prédits pour la liaison des nucléotides. En se basant sur de précédents résultats (Shimoni-Shor et al. 2010), notre première hypothèse impliquait NAP14, éventuellement avec NAP13, dans un transport de lipides entre les PG et les thylakoïdes. Cependant, cette thèse démontre que NAP13 est extrinsèquement associée à l’enveloppe interne du chloroplaste, alors que NAP14 cofractionne avec les thylakoïdes. Les mutants <i>nap13</i> et <i>-14</i> ont un phénotype albinos, ce qui souligne une fonction essentielle au sein du chloroplaste. Notons que <i>nap13</i> et <i>-14</i> ont un profile lipidique similaire, bien que distinct de trois autres mutants albinos. L’observation la plus pertinente étant leur taux réduit de phosphatidyléthanolamine 16:0/18:3. Les similarités partagées par <i>nap13</i> et <i>-14</i> suggèrent que les protéines correspondantes contribuent à la même voie métabolique. D’après nos résultats, il s’agirait d’un transport de lipides au niveau de l’enveloppe. <br> Dans le chapitre III, nous décrivons la caractérisation de CCD4, une enzyme qui clive les caroténoïdes, et son association physique et fonctionnelle avec les PG. La fusion d’une protéine fluorescente avec CCD4 a donné lieu à un signal ponctué dans les chloroplastes typique d’une localisation aux PG <i>in vivo</i>. Pour élucider la fonction de CCD4, une étude de lipidomique comparative de mutants <i>ccd4</i> et de plantes sauvages a été effectuée sous diverses conditions. Les résultats indiquent que CCD4 est impliquée dans la dégradation du β-carotène et de la lutéine lors de la sénescence des feuilles. Pour approfondir, nous avons conçu des lignées de surexpresseurs 35S:CCD4-YFP. En conclusion, nos résultats indiquent que le β-carotène, la lutéine et la violaxanthine sont les principaux substrats de CCD4 <i>in vivo</i> durant la différenciation du chloroplaste en gérontoplaste., Photosynthesis is the key bioenergetic process taking place in the chloroplast. The components of the photosynthetic machinery are embedded in a highly dynamic matrix, the thylakoid membrane. The galactolipids are the major polar lipid components of the thylakoid membrane conferring bilayer properties, while neutral thylakoid lipids such as the prenyllipids and carotenoids contribute to essential functions such as electron transport and photoprotection. Despite a large number of studies, the intriguing processes of thylakoid membrane biogenesis and dynamics remain unsolved. Plastoglobules, thylakoid-associated lipid droplets, appear to actively participate in thylakoid function from biogenesis to senescence. Recruitment of specific proteins enables the plastoglobules to act in metabolite synthesis, repair and disposal under changing environmental conditions and developmental stages. In the first chapter of this thesis, we review plastoglobules as thylakoid membrane microdomains and discuss their involvement in lipid remodeling during stress and in the conversion from one plastid type to another. <br> The second chapter is dedicated to the characterization of NAP13 (ABCI10) and -14 (ABCI11). These two proteins belong to the large ABC family. Each member of the ABCI subfamily consists of only one of the typical domains of a full ABC transporter. <i>NAP13</i> and <i>-14</i> encode two predicted nucleotide-binding domains. Based on earlier results (Shimoni-Shor et al. 2010), our first hypothesis was that NAP14, possibly together with NAP13, are involved in lipid translocation between PG and thylakoids. However, this thesis demonstrates that NAP13 is extrinsically associated with the chloroplast inner envelope while NAP14 cofractionated with the thylakoid membrane. Both the <i>nap13</i> and <i>-14</i> mutants had albino phenotypes, emphasizing essential functions in the chloroplast. Interestingly, <i>nap13</i> and <i>-14</i> showed similar lipid profiles but distinct from three unrelated albino mutants. The most relevant observation was their reduced level of phosphatidylethanolamine 16:0/18:3. The striking similarities shared by <i>nap13</i> and <i>-14</i> suggest that they contribute to the same functional pathway. We hypothesize that this may be lipid transport at the envelope rather than between PG and thylakoids. <br> In the third chapter, we describe the characterization of CCD4, a carotenoid cleavage dioxygenase, and its physical and functional association with PG. Fluorescence-tagged CCD4 resulted in a punctate pattern inside chloroplasts typical for PG localization <i>in vivo</i>. To discover the function of CCD4, a comparative lipidomics study of Arabidopsis <i>ccd4</i> mutants and wild type was carried out under various conditions (light stress, senescence, <i>Pseudomonas syringae</i> infection). The results indicated that CCD4 is implicated in β-carotene and lutein degradation during leaf senescence. To further investigate the function of the enzyme, we engineered 35S:CCD4-YFP overexpressing lines. In conclusion, our findings indicate that β-carotene, lutein and violaxanthin are the principle substrates of CCD4 <i>in vivo</i> during chloroplast to gerontoplast differentiation.
Notes
Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel, 2016
Identifiants
Type de publication
doctoral thesis
Dossier(s) à télécharger