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Kessler, Félix

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Kessler, Félix
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Fonction
Professeur ordinaire
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felix.kessler@unine.ch
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https://libra.unine.ch/handle/123456789/320

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    Chloroplast lipid droplet type II NAD(P)H oxidoreductase, NDC1, is essential for vitamin E and K1 metabolism
    (2017)
    Eugeni Piller, Lucia 
    ;
    Kessler, Félix 
    Les cellules végétales possèdent dans leurs différents tissus des organelles spécialisées appartenant à la famille des plastes. Le chloroplaste est le principal membre de cette famille et il est responsable de la photosynthèse dans les plantes. La majorité des plastes contiennent des particules lipoprotéiques ("gouttelettes lipidiques") appelées plastoglobules.
    Peu est connu au sujet des plastoglobules qui ont été pendant une longue période imaginés comme des gouttelettes de stockage passif. En effet, le cœur hydrophobe des plastoglobules chloroplastiques contiennent des lipides neutres comme les prénylquinones (plastoquinone, plastochromanol-8, phylloquinone, tocophérol), les caroténoïdes, les triacylglycérols, les phytyl esters et d'autres lipides inconnus.
    Les plastoglobules sont aussi composés de protéines et certaines d'entre-elles participent à des réactions métaboliques qui se déroulent dans les plastoglobules.
    Pendant mon doctorat, j’ai démontré que NDC1 (NADP(H) déshydrogénase C1 (At5g08740), prédite comme une NAD(P)H-dépendante réductase de quinones, est physiquement associé aux gouttelettes lipidiques des chloroplastes.
    Grâce à la génétique inverse et une approche in vitro il a été démontré que NDC1 contrôle l'état redox du réservoir de plastoquinone en injectant des électrons dans le plastoquinone à l’intérieur des plastoglobules. Cet effet sur l'état redox des plastoquinones facilitent l'accumulation du plastochromanol. Nous pouvons supposer que NDC1 puisse jouer un rôle en tant que réducteur des intermédiaires quinones qui précèdent la cyclisation par VTE1.
    De manière surprenante, NDC1 est requis pour la dernière étape de méthylation lors de la biosynthèse de la phylloquinone (Vitamine K1). En effet, les mutants ndc1 accumulent le précurseur non-méthylé, le 2-phythyl-1,4-naphtoquinone ce qui montre que NDC1 est une enzyme indispensable de cette voie de biosynthèse.
    L’ensemble des découvertes permettent d'affirmer que les plastoglobules ne sont pas un simple lieu de stockage de lipides mais ils possèdent un rôle dans les métabolismes biosynthétique et énergétique., Plant cells in different tissues contain specialized organelles belonging to the family of plastids. The chloroplast is the most prominent family member and responsible for photosynthesis in leaves. Most plastid types contain lipoprotein particles ("lipid droplets") termed plastoglobules. Little is known about plastoglobules that were long regarded as passive storage droplets. Indeed, the hydrophobic core of chloroplast plastoglobules contains neutral lipids such as the prenylquinones, carotenoids, triacylglycerols, phytyl esters and others unknown. Plastoquinone, plastochromanol-8, phylloquinone and tocopherol are prenylquinone molecules stored partly in the plastoglobule but functioning in the chloroplast thylakoids. Plastoglobules also carry proteins and some of these have been demonstrated to participate in metabolic reactions taking place at plastoglobules.
    During my PhD work I demonstrated that NDC1 (NAD(P)H dehydrogenase C1 (At5g08740)), a candidate plastoglobule protein and predicted NAD(P)H-dependent quinone reductase is physically associated with the lipid droplets. A combined reverse genetic and in vitro approach demonstrated that NDC1 controls the overall REDOX state of the total plastoquinone reservoir. NDC1 does so by reducing the plastoquinone reservoir of plastoglobules. These findings provided evidence that plastoglobules are not simply a lipid storage site but have a role in energy metabolism. Besides its effects on the plastoquinone REDOX state NDC1 also facilitates plastochromanol accumulation and, surprisingly, is required for the last methylation step in phylloquinone (Vitamin K1) biosynthesis. The ndc1 mutant accumulates the non-methylated precursor, the 2-phythyl-1,4-naphtoquinone but up to now we have been unable to determine the precise mechanism. In conclusion, I have shown that NDC1 is a unique electron input device affecting the REDOX state of the overall plastoquinone pool. But more than that NDC1 is a key player at the intersection of a variety of prenylquinone metabolic pathways. By mutant analysis, I identified that NDC1 is the second enzyme that is implicated in the tocopherol redox cycle. Presumably NDC1 plays a role as reducer of quinone intermediates foregoing the cyclization by VTE1. It has been also demonstrated that high light stress triggers far-ranging changes in prenylquinone composition studied in mutants and overexpressing lines of VTE1 and NDC1 enzymes. The discovery that NDC1 is a new component of phylloquinone biosynthesis pathway is the single most important result of my thesis.
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    Investigations of candidate plastoglobule proteins: characterization of chloroplast NON-INTRINSIC ABC PROTEINS 13 and -14 in "Arabidopsis thaliana" & Constitutive expression of CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 4 leads to a reduced level of photosynthesis-related carotenoids during senescence
    (2016)
    Rottet, Sarah
    ;
    Kessler, Félix 
    La photosynthèse est le processus clé se déroulant au sein du chloroplaste. La machinerie photosynthétique est intégrée à une matrice très dynamique, la membrane des thylakoïdes. Les galactolipides, les principaux lipides polaires de cette membrane, lui confèrent la propriété de bicouche alors que les lipides neutres tels que les prényllipides et les caroténoïdes contribuent à d’essentielles fonctions telles que le transport d’électrons et la photoprotection. Malgré de nombreuses études, la biogénèse et la dynamique des thylakoïdes restent irrésolus. Les plastoglobules (PG), des gouttelettes lipidiques associées aux thylakoïdes, participent activement aux fonctions des thylakoïdes. Sous un environnement changeant et lors des différents stades de développement, le recrutement d’enzymes spécifiques permet aux PG de participer à la synthèse, la réparation et l’élimination des métabolites. Dans le premier chapitre de cette thèse, nous passons en revue les PG en tant que microdomaines des thylakoïdes et discutons leur implication dans le remodelage lipidique lors de stress et lors de la conversion d’un type de plaste à l’autre.
    Le chapitre II est dédié à la caractérisation de NAP13 (ABCI10) et -14 (ABCI11). Ces deux protéines appartiennent à la grande famille des ABC. Chaque membre de la sous-famille ABCI présente un seul des domaines typiques des transporteurs ABC. NAP13 et -14 codent deux domaines prédits pour la liaison des nucléotides. En se basant sur de précédents résultats (Shimoni-Shor et al. 2010), notre première hypothèse impliquait NAP14, éventuellement avec NAP13, dans un transport de lipides entre les PG et les thylakoïdes. Cependant, cette thèse démontre que NAP13 est extrinsèquement associée à l’enveloppe interne du chloroplaste, alors que NAP14 cofractionne avec les thylakoïdes. Les mutants nap13 et -14 ont un phénotype albinos, ce qui souligne une fonction essentielle au sein du chloroplaste. Notons que nap13 et -14 ont un profile lipidique similaire, bien que distinct de trois autres mutants albinos. L’observation la plus pertinente étant leur taux réduit de phosphatidyléthanolamine 16:0/18:3. Les similarités partagées par nap13 et -14 suggèrent que les protéines correspondantes contribuent à la même voie métabolique. D’après nos résultats, il s’agirait d’un transport de lipides au niveau de l’enveloppe.
    Dans le chapitre III, nous décrivons la caractérisation de CCD4, une enzyme qui clive les caroténoïdes, et son association physique et fonctionnelle avec les PG. La fusion d’une protéine fluorescente avec CCD4 a donné lieu à un signal ponctué dans les chloroplastes typique d’une localisation aux PG in vivo. Pour élucider la fonction de CCD4, une étude de lipidomique comparative de mutants ccd4 et de plantes sauvages a été effectuée sous diverses conditions. Les résultats indiquent que CCD4 est impliquée dans la dégradation du β-carotène et de la lutéine lors de la sénescence des feuilles. Pour approfondir, nous avons conçu des lignées de surexpresseurs 35S:CCD4-YFP. En conclusion, nos résultats indiquent que le β-carotène, la lutéine et la violaxanthine sont les principaux substrats de CCD4 in vivo durant la différenciation du chloroplaste en gérontoplaste., Photosynthesis is the key bioenergetic process taking place in the chloroplast. The components of the photosynthetic machinery are embedded in a highly dynamic matrix, the thylakoid membrane. The galactolipids are the major polar lipid components of the thylakoid membrane conferring bilayer properties, while neutral thylakoid lipids such as the prenyllipids and carotenoids contribute to essential functions such as electron transport and photoprotection. Despite a large number of studies, the intriguing processes of thylakoid membrane biogenesis and dynamics remain unsolved. Plastoglobules, thylakoid-associated lipid droplets, appear to actively participate in thylakoid function from biogenesis to senescence. Recruitment of specific proteins enables the plastoglobules to act in metabolite synthesis, repair and disposal under changing environmental conditions and developmental stages. In the first chapter of this thesis, we review plastoglobules as thylakoid membrane microdomains and discuss their involvement in lipid remodeling during stress and in the conversion from one plastid type to another.
    The second chapter is dedicated to the characterization of NAP13 (ABCI10) and -14 (ABCI11). These two proteins belong to the large ABC family. Each member of the ABCI subfamily consists of only one of the typical domains of a full ABC transporter. NAP13 and -14 encode two predicted nucleotide-binding domains. Based on earlier results (Shimoni-Shor et al. 2010), our first hypothesis was that NAP14, possibly together with NAP13, are involved in lipid translocation between PG and thylakoids. However, this thesis demonstrates that NAP13 is extrinsically associated with the chloroplast inner envelope while NAP14 cofractionated with the thylakoid membrane. Both the nap13 and -14 mutants had albino phenotypes, emphasizing essential functions in the chloroplast. Interestingly, nap13 and -14 showed similar lipid profiles but distinct from three unrelated albino mutants. The most relevant observation was their reduced level of phosphatidylethanolamine 16:0/18:3. The striking similarities shared by nap13 and -14 suggest that they contribute to the same functional pathway. We hypothesize that this may be lipid transport at the envelope rather than between PG and thylakoids.
    In the third chapter, we describe the characterization of CCD4, a carotenoid cleavage dioxygenase, and its physical and functional association with PG. Fluorescence-tagged CCD4 resulted in a punctate pattern inside chloroplasts typical for PG localization in vivo. To discover the function of CCD4, a comparative lipidomics study of Arabidopsis ccd4 mutants and wild type was carried out under various conditions (light stress, senescence, Pseudomonas syringae infection). The results indicated that CCD4 is implicated in β-carotene and lutein degradation during leaf senescence. To further investigate the function of the enzyme, we engineered 35S:CCD4-YFP overexpressing lines. In conclusion, our findings indicate that β-carotene, lutein and violaxanthin are the principle substrates of CCD4 in vivo during chloroplast to gerontoplast differentiation.
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    On the role of chloroplast plastoglobule lipoprotein particles vitamin E biosynthesis
    (2006)
    Vidi, Pierre-Alexandre
    ;
    Kessler, Félix 
    Les chloroplastes contiennent des corps protéo-lipidiques connus sous le nom de plastoglobules. Les plastoglobules ont longtemps été considérés comme des sites de stockage de lipides. Cependant, des études ont montré que leur nombre et leur volume augmente dans des situations de stress oxydatif. Ces structures ont donc un comportement dynamique. Des protéines structurelles appartenant à la famille des PAP/fibrillines, sont associées aux plastoglobules et leur expression est positivement régulée par plusieurs types de stress environnementaux. Nous avons identifié AtPGL35, une protéine marqueur pour les plastoglobules dans la plante Arabidopsis thaliana, et montré que la synthèse de cette protéine est induite par divers stress oxydatifs. En parallèle, des observations microscopiques ont montré une augmentation de la taille des plastoglobules dans des chloroplastes exposés à un stress oxydatif. Dans le dessein de découvrir de nouveaux composants et de nouvelles fonctions des plastoglobules, un extrait protéique issu de plastoglobules purifiés a été analysé par spectrométrie de masse. Les peptides identifiés appartenaient à des PAP/fibrillines ainsi qu’à des enzymes dont la tocopherol cyclase (AtVTE1), catalysant la pénultième étape de la biosynthèse de l’-tocopherol (la vitamine E). De plus, un fort enrichissement en tocophérols a été mesuré dans les plastoglobules. Des résultats suggérant que AtVTE1 est la seule enzyme de la voie de synthèse des tocophérols à être localisée dans les plastoglobules sont présentés. La présence de AtVTE1 en association avec les plastoglobules indique que ces corps lipidiques ne sont pas uniquement des sites de stockage, mais qu’ils participent à la synthèse de la vitamine E. Actuellement, les protéines recombinantes destinées à la médecine et à l’industrie sont principalement produites par des microorganismes ou des cultures de cellules animales. Dans l’optique de limiter les coûts de production et les risques liés aux pathogènes dans les systèmes animaux, les plantes représentent une alternative intéressante ("l’agriculture moléculaire"). Si la production de matériel végétal est peu coûteuse, les étapes de purifications sont un obstacle pour cette technologie. Afin de simplifier les procédures de purification, nous proposons de tirer parti de la faible densité des plastoglobules pour une première étape d’enrichissement. Comme preuve de principe, nous avons généré des plantes exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) fusionnée à une PAP/fibrilline. La protéine chimérique a été localisée dans les plastoglobules des plantes transgéniques et a pu être fortement enrichie par une simple centrifugation sur gradient. L’accumulation de la protéine recombinante n’a pas eu de conséquence néfaste apparente pour les plantes. Ces résultats démontrent que les plastoglobules représentent un site d’adressage prometteur pour l’agriculture moléculaire., Chloroplasts contain lipoprotein particles termed plastoglobules. Plastoglobules are generally believed to have little function beyond lipid storage. However, increased plastoglobule size and number has been correlated with oxidative stress conditions indicating dynamic behaviour. Structural proteins from the PAP/fibrillin family are associated with plastoglobules and are upregulated under various environmental stresses. We have identified AtPGL35 as an Arabidopsis thaliana plastoglobule marker protein, and shown that its upregulation under oxidative stress conditions parallels increase of plastoglobule size in chloroplasts. In order to discover new components and functions of plastoglobules, proteins from purified Arabidopsis plastoglobules have been identified by tandem mass spectrometry. The identified peptides belonged to PAP/fibrillins and to known metabolic enzymes including the tocopherol cyclase (AtVTE1), catalysing the penultimate step of  tocopherol (Vitamin E) biosynthesis. In addition, plastoglobules were shown to be a major site of -tocopherol accumulation. The data presented suggest that the cyclase reaction is the only step of the -tocopherol biosynthesis pathway occurring in plastoglobules. Association of AtVTE1 with plastoglobules indicates that these lipid-bodies are not mere storage sites for tocopherols but that they are involved in their synthesis. Plants are emerging as cost-effective alternatives for the production of recombinant proteins. Extraction and purification of transgene products are however obstacles for so-called molecular farming. We propose to take advantage of the low-density of plastoglobules for efficient recovery of recombinant proteins. As a proof-of-concept, the yellow fluorescent protein (YFP), fused to an Arabidopsis PAP/fibrillin, was targeted to plastoglobules and purified by a simple gradient flotation centrifugation procedure. Accumulation of the recombinant protein had no apparent effect on plant viability. These results identify plastoglobules as a promising sub-organellar compartment for molecular farming.