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Kessler, Félix
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Kessler, Félix
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felix.kessler@unine.ch
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- PublicationAccès libreCharacterization of domesticated clove ("Syzygium aromaticum") and comparison with related species(2024)
; ; Ivanov NicolaiLe giroflier, Syzygium aromaticum, est un arbre à épices appartenant à la famille des Myrtacées. Les boutons floraux encore fermés et séchés (clous de girofle), l'huile essentielle et l'oléorésine produits à partir du giroflier sont riche en eugénol et utilisés commercialement dans un large éventail d'industries. Malgré son importance économique et le potentiel thérapeutique prometteur de l'eugénol, peu de données omiques étaient disponibles pour la recherche fondamentale et appliquée sur le giroflier. Un génome de référence est un outil important pour l'avancement de la recherche en biologie végétale et des programmes d'amélioration des cultures. Dans le cadre de cette thèse, le génome du giroflier a été séquencé, et assemblé à l'échelle chromosomique, puis analysé en utilisant des approches de génomique comparative et multi-omiques dans le but d’étudier l'évolution du génome du giroflier et la base génétique de la biosynthèse de l'eugénol. Les assemblages des génomes de Syzygium malaccense (430 Mb), Syzygium aqueum (392 Mb), Syzygium jambos (426 Mb), et Syzygium syzygioides (431 Mb) ont également été construits pour être comparés aux génomes du giroflier (370 Mb), de Syzygium grande (405 Mb) ainsi qu’au génome d’une autre espèce de Myrtacées, Eucalyptus grandis (690 Mb), afin d'acquérir de nouvelles connaissances sur l'évolution des génomes des espèces de Syzygium. En analysant l'assemblage du génome du giroflier et en intégrant les données transcriptomiques et métabolomiques produites à partir des feuilles et des bourgeons floraux, les principales familles de gènes impliquées dans la biosynthèse des précurseurs de la lignine et des phénylpropènes volatils (eugénol, isoeugénol, chavicol) ont été identifiées ainsi que les gènes potentiellement impliqués dans la biosynthèse de l'eugénol. Sur la base de cette étude multiomiques, nous avons émis l'hypothèse que l'acétate d'eugénol pourrait jouer un rôle clé dans la forte accumulation d'eugénol dans les feuilles et les bourgeons floraux du giroflier. En outre, un nombre inférieur de gènes codant pour une possible eugénol synthase — une enzyme clé dans la biosynthèse de l'eugénol — ont été identifiés dans les génomes des 4 espèces de Syzygium nouvellement assemblés (1 à 3) que dans le génome du giroflier (15), suggérant que cette variation du nombre de copie peut être impliquée dans la teneur élevée en eugénol des organes de ce dernier. Les analyses de synténie ont révélé une bonne conservation de l'organisation chromosomique des 6 espèces de Syzygium étudiées et des réarrangements intrachromosomiques sur 7 des 11 chromosomes entre les espèces de Syzygium et E. grandis. Ces nouveaux génomes de Syzygium sont une contribution précieuse aux ressources génomiques de la famille des Myrtacées, et en particulier pour le genre Syzygium, le plus riche en espèces d’arbre au monde. De plus, la disponibilité d’un génome de référence pour le giroflier ouvre de nouvelles perpectives pour la recherche appliquée visant à optimiser la productivité des girofliers. ABSTRACT Clove, Syzygium aromaticum, is a valuable spice crop tree belonging to the Myrtaceae family. Its dried, unopened flower buds, essential oil, and oleoresin-rich in eugenol, are used commercially in a broad range of industries. Despite its economic importance and the promising therapeutic potential of eugenol, little -omics information was available for fundamental and applied research on clove. A reference genome is an important tool for the advancement of plant biology research and crop improvement programs. In this thesis, the clove genome was sequenced, assembled at the chromosome level and subsequently analysed using comparative genomics and multi-omics approaches to investigate clove genome evolution and the genetic basis of eugenol biosynthesis. In addition, the genome assemblies of Syzygium malaccense (430 Mb), Syzygium aqueum (392 Mb), Syzygium jambos (426 Mb), and Syzygium syzygioides (431 Mb) were constructed and compared to the genome assemblies of clove (370 Mb), Syzygium grande (405 Mb) and their Myrtaceae relative Eucalyptus grandis (690 Mb) to provide further genomic insights into the evolution of Syzygium genomes. By analysing the clove genome assembly and sets of transcriptomic and metabolomic data from leaves and buds, the key gene families involved in the biosynthesis of the precursor of lignin and phenylpropene volatiles (eugenol, isoeugenol, chavicol) were identified as well as genes possibly involved in the biosynthesis of eugenol. On the basis of this multi -omics study, we hypothesized that eugenol acetate may play a key role in the high accumulation of eugenol in clove leaves and buds. Fewer genes were found in the newly assembled Syzygium genomes (1 to 3) than in clove (15) to encode for putative eugenol synthase—a key enzyme in the eugenol biosynthetic pathway—suggesting that this copy number variation may be involved in the high content in eugenol of clove. Synteny analyses revealed a high conservation of the chromosomal organization of the 6 Syzygium species studied and intrachromosomal rearrangements on 7 of the 11 chromosomes, between the Syzygium species and E. grandis. This new set of Syzygium genomes is a valuable contribution to genomics resources for the Myrtaceae family, and especially to the Syzygium genus, the world’s most species-rich tree genus. Moreover, the availability of the clove reference genome opens new perspectives for applied research aiming to optimize clove production. - PublicationAccès libreThe atypical kinase ABC1K1 / PGR6 allocates geranylgeranyldiphosphate to the carotenoid biosynthesis pathway(2023)
; Les espèces fruitières cultivées jouent un rôle important dans la vie sur Terre. En effet, les fruits fournissent des nutriments et des vitamines essentiels qui ne sont pas synthétisés par l'homme mais qui sont nécessaires à sa santé. La synthèse de ces nutriments essentiels a lieu au cours du processus complexe de maturation et de mûrissement des fruits, orchestré par des gènes régulateurs, des facteurs de transcription et des hormones. Au cours de ce processus, de nombreux événements biologiques et physiologiques entraînent des changements dans les fruits et sont indispensables pour la couleur, la saveur, l'arôme et la qualité des fruits. Dans le fruit de la tomate, nombre de ces événements biologiques se produisent dans un plaste coloré spécialisé dans la biosynthèse et la séquestration des caroténoïdes, le chromoplaste. La couleur rouge caractéristique des fruits de la tomate est due à la synthèse et à l'accumulation de lycopène dans un compartiment lipoprotéique sous-organellaire des chloroplastes et des chromoplastes appelé plastoglobule (PG). Le noyau hydrophobe des plastoglobules des chloroplastes et des chromoplastes sert de réservoir et de compartiment de biosynthèse des esters de phytyle, des lipides prényliques et des caroténoïdes. Dans le premier chapitre intitulé "Plastoglobules : A hub of lipid metabolism in the chloroplast" (Shanmugabalaji et al., 2022), nous avons passé en revue les fonctions et le métabolisme des plastoglobules dans différents types de plastes. Dans le deuxième chapitre "Chapter II : Les plastoglobules du chromoplaste recrutent la voie de biosynthèse des caroténoïdes et contribuent à l'accumulation des caroténoïdes pendant la maturation du fruit de la tomate " (Zita et al., 2022), nous avons utilisé une approche protéomique pour étudier le remodelage du protéome des plastoglobules pendant la transition chloroplaste-chromoplaste dans le fruit de la tomate. Cette étude protéomique a révélé que le plastoglobule de la tomate contient environ 30 protéines et des membres de différentes familles d'enzymes dont les fibrillines (FBNs), l'activité du complexe BC1 kinase (ABC1Ks), la tocophérol cyclase (VTE1), la NAD(P)H-ubiquinone oxydoréductase C1 (NDC1). L'étude a révélé la présence de la voie complète de biosynthèse des caroténoïdes dans les plastoglobules du chromoplaste : phytoène synthase 1 (PSY1), phytoène désaturase (PDS), zeta carotène désaturase (ZDS), caroténoïde isomérase (CRTISO), et lycopène beta cyclase (LYC-B). Les résultats montrent que le plastoglobule devient une plateforme pour la biosynthèse des caroténoïdes pendant la transition chloroplaste-chromoplaste. En outre, les lipidomes du chloroplaste et du plastoglobule du chromoplaste subissent un remodelage au cours des étapes de maturation progressive du fruit. En particulier, le β-carotène et le lycopène sont fortement enrichis dans les plastoglobules du chromoplaste par rapport aux plastoglobules du chloroplaste. Dans l'ensemble, ce chapitre démontre que le plastoglobule joue un rôle central dans le processus de maturation. Dans le troisième chapitre "A quantitative method to measure geranylgeranyl diphosphate (GGPP) and geranylgeranyl monophosphate (GGP) in tomato (Solanum lycopersicum) fruit" (Zita et al., 2023), une méthode de quantification du GGPP à partir de tissus de fruits de tomates a été mise au point en utilisant la chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (UHPLC-MS/MS). La méthode a été validée en utilisant un type sauvage (WT) et des matrices mutantes défectueuses dans la synthèse du GGPP. En outre, ce chapitre souligne l'importance de la préparation des échantillons pour préserver le GGPP et limiter sa conversion en GGP (produit hydrolysé). Cette méthode est essentielle pour la suite de l'analyse dans ma thèse. Enfin, dans le quatrième chapitre de ma thèse "An atypical kinase ABC1K1 allocates geranylgeranyl diphosphate to the carotenoid biosynthesis pathway in plastoglobules of chromoplasts", j'étudie le rôle de SlABC1K1 dans le métabolisme des caroténoïdes du fruit de la tomate. Le mutant CRISPR-Cas9 de SlABC1K1 (slabc1k1) présente le phénotype photosynthétique PGR6 dans les feuilles qui avait été observé précédemment chez Arabidopsis. De manière surprenante, les fruits de slabc1k1 présentaient un phénotype orange. Le phénotype slabc1k1 est lié à une accumulation réduite de lycopène et de son précurseur, le phytoène. Sur la base de nos résultats, je propose deux scénarios possibles pour la fonction de SlABC1K1 dans les plastoglobules des fruits de tomate. SlABC1K1 peut agir comme un régulateur clé pour l'allocation du géranylgéranyl diphosphate (GGPP) à la voie des caroténoïdes ou comme un co-régulateur des enzymes de biosynthèse des caroténoïdes dans les plastoglobules. La découverte que SlABC1K1 est nécessaire pour l'allocation du GGPP au plastoglobule est le principal résultat de ma thèse. ABSTRACT Crop fruit species play an important role in life on Earth. Indeed, fruits provide essential nutrients and vitamins which are not synthesized by humans but are necessary for their health. The synthesis of these essential nutrients occurs during the complex process of fruit maturation and ripening, orchestrated by regulatory genes, transcription factors, and hormones. During this process, many biological, and physiological events lead to fruit changes and are indispensable for the fruit color, flavor, aroma and quality. In tomato fruit, many of these biological events occur in a colored plastid specialized in carotenoid biosynthesis and sequestration, the chromoplast. The hallmark red color of tomato fruit is due to the synthesis and accumulation of lycopene in a lipoprotein sub-organellar compartment of chloroplasts and chromoplasts called plastoglobule (PG). The hydrophobic core of chloroplast and chromoplast plastoglobules serves as a reservoir and biosynthetic compartment of phytyl esters, prenyl lipids and carotenoids. In the first chapter entitled “Plastoglobules: A hub of lipid metabolism in the chloroplast” (Shanmugabalaji et al., 2022) we reviewed plastoglobule functions and metabolism in different plastid types. In the second chapter “Chapter II: Chromoplast plastoglobules recruit the carotenoid biosynthetic pathway and contribute to carotenoid accumulation during tomato fruit maturation” (Zita et al., 2022), we used a proteomic approach to investigate plastoglobule proteome remodeling during the chloroplast to chromoplast transition in tomato fruit. This proteomic study revealed that the tomato plastoglobule contains around 30 proteins and members of different enzyme families including fibrillins (FBNs), the activity of BC1 complex kinase (ABC1Ks), tocopherol cyclase (VTE1), AD(P)Hubiquinone oxidoreductase C1 (NDC1). The study revealed the presence of the complete carotenoid biosynthesis pathway in chromoplast plastoglobules: phytoene synthase 1 (PSY1), phytoene desaturase (PDS), zeta carotene desaturase (ZDS), carotenoid isomerase (CRTISO), and lycopene beta cyclase (LYC-B). The results show that the plastoglobule becomes a platform for carotenoid biosynthesis during the chloroplast to chromoplast transition. In addition, the lipidomes of chloroplast and chromoplast plastoglobule undergo remodeling during progressive fruit ripening stages. Specifically, β-carotene and lycopene were highly enriched in chromoplast plastoglobules compared to chloroplast plastoglobules. Overall, the chapter demonstrates that the plastoglobule plays a central role in the ripening process. The third chapter “A quantitative method to measure geranylgeranyl diphosphate (GGPP) and geranylgeranyl monophosphate (GGP) in tomato (Solanum lycopersicum) fruit” (Zita et al., 2023), a method to quantify GGPP from tomato fruit tissue was developed using ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). The method has been validated by using a wild-type (WT) and mutant matrices defective in GGPP synthesis. In addition, this chapter highlight the importance of sample preparation to preserve the GGPP and limited its conversion to GGP (hydrolyzed product). This method is essential for further analysis in my thesis. Finally, in the fourth chapter of my thesis “An atypical kinase ABC1K1 allocates geranylgeranyl diphosphate to the carotenoid biosynthesis pathway in plastoglobules of chromoplasts”, I investigate the role of SlABC1K1 in tomato fruit carotenoid metabolism. The CRISPR-Cas9 mutant of SlABC1K1 (slabc1k1) showed the photosynthetic PGR6 phenotype in leaves that had previously been observed in Arabidopsis. Surprisingly, slabc1k1 fruit had an orange phenotype. The slabc1k1 phenotype was linked to reduced lycopene accumulation as well as that of its phytoene precursor. Based on our results, I propose two possible scenarios for the function of SlABC1K1 in tomato fruit plastoglobules. SlABC1K1 may acts as a key regulator for geranylgeranyl diphosphate (GGPP) allocation to the carotenoid pathway or as a co-regulator of carotenoid biosynthesis enzymes in plastoglobules. The discovery that SlABC1K1 is required for the GGPP allocation to plastoglobule is the principal result of my thesis. - PublicationMétadonnées seulementCharacterization of a Plastoglobule-Localized SOUL4 Heme-Binding Protein in Arabidopsis thaliana(2020-1-31)Heme plays an active role in primary plant metabolic pathways as well as in stress signaling. In this study, we characterized the predicted heme-binding protein SOUL4. Proteomics evidence suggests that SOUL4 is a component of Arabidopsis plastoglobules (PGs, chloroplast lipid droplets). SOUL4 contains heme-binding motifs and the recombinant protein is shown here to bind heme in vitro. Fluorescence-tagged SOUL4 colocalized with the specific PG marker Fibrillin1A (FBN1A) in transiently transformed Nicotiana benthamiana leaves. In addition, SOUL4 cofractionated with another PG marker Fibrillin2 (FBN2) in sucrose gradient ultracentrifugation experiments. In vitro kinase experiments revealed that SOUL4 is phosphorylated by a yet unknown chloroplast protein kinase. Our data demonstrate that SOUL4 is a bona fide PG protein and may function in heme-buffering in the chloroplast.
- PublicationAccès libreHow chloroplasts protect themselves from unfolded proteins(2019-10-15)
; A genetic screen has identified the first signaling component of the unfolded protein response in chloroplasts. - PublicationAccès librePlastoquinone homoeostasis by Arabidopsis proton gradient regulation 6 is essential for photosynthetic efficiency(2019-6-20)
; ; ; ; ; - PublicationAccès libreThe novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery(2017)
Toc159 joue un rôle essentiel dans la biogenèse du chloroplaste. Les bases de données de phosphoprotéomique montrent que le domaine A de Toc159 est fortement phosphorylé. La protéine cytosolique caséine kinase II phosphoryle le domaine A in vitro. Toutefois d’autres kinases ayant la même fonction ont aussi été prédites. Tandis que la phosphorylation contrôle l’assemblage et l’activité des complexes d’importation de protéines dans les chloroplastes et les mitochondries, aucune kinase organite-spécifique n’a été identifiée jusqu’à présent. Par co-purification avec Toc159, nous avons découvert une protéine kinase dans la membrane externe du chloroplaste (KOC1 « Kinase at the Outer Chloroplast membrane 1 »). KOC1 est une protéine intégrale de membrane orientée vers le cytosol et associée de manière stable avec le complexe TOC. KOC1 phosphoryle le domaine A chez les membres de la famille Toc159 in vitro. Dans les chloroplastes des mutants koc1, l’efficience de l’importation des protéines a été réduite. Par ailleurs, les plantules koc1 ont un taux de survie réduit quand elles sont déplacées de l’obscurité à la lumière, quand une importation rapide des pré-protéines est nécessaire pour une biogenèse de chloroplastes complète. Nos résultats indiquent que KOC1 est un composant de la machinerie d’importation TOC en phosphorylant les récepteurs, en soutenant l’importation de pré-protéines et en contribuant à une biogenèse de chloroplastes efficiente., The chloroplast constitutes the site of photosynthesis and is an essential organelle in plant cells. An endosymbiotic event was at the origin of the chloroplast, an ancestral eukaryotic cell engulfing a photosynthetic cyanobacterium. During evolution, the majority of ancestral chloroplast genes were lost or transferred to the nucleus. The protein products of the successfully transferred genes are now synthesized by cytosolic ribosomes and imported into the chloroplast. The chloroplast destined proteins (preproteins) acquired an additional sequence that encodes a cleavable N-terminal targeting peptide (transit peptides). The transit peptide is recognized by the chloroplast import machinery, which initiates import. The import machinery consists of translocon complexes at the outer (TOC) and inner membrane of the chloroplast (TIC). The import of hundreds of different chloroplast proteins depends on TOC and TIC complexes. The TOC complex core contains three proteins, the GTPase receptors: Toc159, Toc34 and the channel Toc75, together they recognize and transfer the pre-proteins across the outer membrane of the chloroplast. Both Toc34 and Toc159 are exposed at the surface of the chloroplast, consistent with a receptor function, and have homologous GTP-binding domains (G-domain). In addition to the G-domain, Toc159 has a N-terminal A- (acidic) domain that extends into the cytosol and controls receptor specificity and a C-terminal membrane anchoring M-domain. Toc75 belongs to the OMP85 family that serves to integrate proteins into the outer membrane of gram negative bacteria, in chloroplasts it has evolved to provide a protein translocation channel across the outer membrane.
Toc159 plays an essential role in chloroplast biogenesis. Phosphoproteomics databases show that Toc159 is highly phosphorylated at the A domain. Cytosolic casein kinase II phosphorylates the A-domain in vitro, however other A-domain kinases have been predicted.
While phosphorylation controls assembly and activity of protein import complexes in both mitochondria and chloroplasts no organelle-specific kinases have been identified so far. By co-purification with Toc159, we discovered "Kinase at the Outer Chloroplast membrane 1" (KOC1). KOC1 is an integral membrane protein facing the cytosol and stably associating with TOC. KOC1 phosphorylated the A-domain of Toc159 family members in vitro. In mutant koc1 chloroplasts preprotein import efficiency was diminished. Moreover, koc1 seedlings had reduced survival rates when moved from the dark to the light when protein import is required to rapidly complete chloroplast biogenesis. Our data indicate that KOC1 is a functional component of the TOC machinery phosphorylating import receptors, supporting preprotein import and contributing to efficient chloroplast biogenesis. - PublicationAccès libreThe role of alpha-tocopherol in the protection of tomato plants against abiotic stress(2017)
- PublicationAccès libreChloroplast lipid droplet type II NAD(P)H oxidoreductase, NDC1, is essential for vitamin E and K1 metabolism(2017)
; Les cellules végétales possèdent dans leurs différents tissus des organelles spécialisées appartenant à la famille des plastes. Le chloroplaste est le principal membre de cette famille et il est responsable de la photosynthèse dans les plantes. La majorité des plastes contiennent des particules lipoprotéiques ("gouttelettes lipidiques") appelées plastoglobules.
Peu est connu au sujet des plastoglobules qui ont été pendant une longue période imaginés comme des gouttelettes de stockage passif. En effet, le cœur hydrophobe des plastoglobules chloroplastiques contiennent des lipides neutres comme les prénylquinones (plastoquinone, plastochromanol-8, phylloquinone, tocophérol), les caroténoïdes, les triacylglycérols, les phytyl esters et d'autres lipides inconnus.
Les plastoglobules sont aussi composés de protéines et certaines d'entre-elles participent à des réactions métaboliques qui se déroulent dans les plastoglobules.
Pendant mon doctorat, j’ai démontré que NDC1 (NADP(H) déshydrogénase C1 (At5g08740), prédite comme une NAD(P)H-dépendante réductase de quinones, est physiquement associé aux gouttelettes lipidiques des chloroplastes.
Grâce à la génétique inverse et une approche in vitro il a été démontré que NDC1 contrôle l'état redox du réservoir de plastoquinone en injectant des électrons dans le plastoquinone à l’intérieur des plastoglobules. Cet effet sur l'état redox des plastoquinones facilitent l'accumulation du plastochromanol. Nous pouvons supposer que NDC1 puisse jouer un rôle en tant que réducteur des intermédiaires quinones qui précèdent la cyclisation par VTE1.
De manière surprenante, NDC1 est requis pour la dernière étape de méthylation lors de la biosynthèse de la phylloquinone (Vitamine K1). En effet, les mutants ndc1 accumulent le précurseur non-méthylé, le 2-phythyl-1,4-naphtoquinone ce qui montre que NDC1 est une enzyme indispensable de cette voie de biosynthèse.
L’ensemble des découvertes permettent d'affirmer que les plastoglobules ne sont pas un simple lieu de stockage de lipides mais ils possèdent un rôle dans les métabolismes biosynthétique et énergétique., Plant cells in different tissues contain specialized organelles belonging to the family of plastids. The chloroplast is the most prominent family member and responsible for photosynthesis in leaves. Most plastid types contain lipoprotein particles ("lipid droplets") termed plastoglobules. Little is known about plastoglobules that were long regarded as passive storage droplets. Indeed, the hydrophobic core of chloroplast plastoglobules contains neutral lipids such as the prenylquinones, carotenoids, triacylglycerols, phytyl esters and others unknown. Plastoquinone, plastochromanol-8, phylloquinone and tocopherol are prenylquinone molecules stored partly in the plastoglobule but functioning in the chloroplast thylakoids. Plastoglobules also carry proteins and some of these have been demonstrated to participate in metabolic reactions taking place at plastoglobules.
During my PhD work I demonstrated that NDC1 (NAD(P)H dehydrogenase C1 (At5g08740)), a candidate plastoglobule protein and predicted NAD(P)H-dependent quinone reductase is physically associated with the lipid droplets. A combined reverse genetic and in vitro approach demonstrated that NDC1 controls the overall REDOX state of the total plastoquinone reservoir. NDC1 does so by reducing the plastoquinone reservoir of plastoglobules. These findings provided evidence that plastoglobules are not simply a lipid storage site but have a role in energy metabolism. Besides its effects on the plastoquinone REDOX state NDC1 also facilitates plastochromanol accumulation and, surprisingly, is required for the last methylation step in phylloquinone (Vitamin K1) biosynthesis. The ndc1 mutant accumulates the non-methylated precursor, the 2-phythyl-1,4-naphtoquinone but up to now we have been unable to determine the precise mechanism. In conclusion, I have shown that NDC1 is a unique electron input device affecting the REDOX state of the overall plastoquinone pool. But more than that NDC1 is a key player at the intersection of a variety of prenylquinone metabolic pathways. By mutant analysis, I identified that NDC1 is the second enzyme that is implicated in the tocopherol redox cycle. Presumably NDC1 plays a role as reducer of quinone intermediates foregoing the cyclization by VTE1. It has been also demonstrated that high light stress triggers far-ranging changes in prenylquinone composition studied in mutants and overexpressing lines of VTE1 and NDC1 enzymes. The discovery that NDC1 is a new component of phylloquinone biosynthesis pathway is the single most important result of my thesis. - PublicationAccès libreInvestigations of candidate plastoglobule proteins: characterization of chloroplast NON-INTRINSIC ABC PROTEINS 13 and -14 in "Arabidopsis thaliana" & Constitutive expression of CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 4 leads to a reduced level of photosynthesis-related carotenoids during senescence(2016)
Le chapitre II est dédié à la caractérisation de NAP13 (ABCI10) et -14 (ABCI11). Ces deux protéines appartiennent à la grande famille des ABC. Chaque membre de la sous-famille ABCI présente un seul des domaines typiques des transporteurs ABC. NAP13 et -14 codent deux domaines prédits pour la liaison des nucléotides. En se basant sur de précédents résultats (Shimoni-Shor et al. 2010), notre première hypothèse impliquait NAP14, éventuellement avec NAP13, dans un transport de lipides entre les PG et les thylakoïdes. Cependant, cette thèse démontre que NAP13 est extrinsèquement associée à l’enveloppe interne du chloroplaste, alors que NAP14 cofractionne avec les thylakoïdes. Les mutants nap13 et -14 ont un phénotype albinos, ce qui souligne une fonction essentielle au sein du chloroplaste. Notons que nap13 et -14 ont un profile lipidique similaire, bien que distinct de trois autres mutants albinos. L’observation la plus pertinente étant leur taux réduit de phosphatidyléthanolamine 16:0/18:3. Les similarités partagées par nap13 et -14 suggèrent que les protéines correspondantes contribuent à la même voie métabolique. D’après nos résultats, il s’agirait d’un transport de lipides au niveau de l’enveloppe.
Dans le chapitre III, nous décrivons la caractérisation de CCD4, une enzyme qui clive les caroténoïdes, et son association physique et fonctionnelle avec les PG. La fusion d’une protéine fluorescente avec CCD4 a donné lieu à un signal ponctué dans les chloroplastes typique d’une localisation aux PG in vivo. Pour élucider la fonction de CCD4, une étude de lipidomique comparative de mutants ccd4 et de plantes sauvages a été effectuée sous diverses conditions. Les résultats indiquent que CCD4 est impliquée dans la dégradation du β-carotène et de la lutéine lors de la sénescence des feuilles. Pour approfondir, nous avons conçu des lignées de surexpresseurs 35S:CCD4-YFP. En conclusion, nos résultats indiquent que le β-carotène, la lutéine et la violaxanthine sont les principaux substrats de CCD4 in vivo durant la différenciation du chloroplaste en gérontoplaste., Photosynthesis is the key bioenergetic process taking place in the chloroplast. The components of the photosynthetic machinery are embedded in a highly dynamic matrix, the thylakoid membrane. The galactolipids are the major polar lipid components of the thylakoid membrane conferring bilayer properties, while neutral thylakoid lipids such as the prenyllipids and carotenoids contribute to essential functions such as electron transport and photoprotection. Despite a large number of studies, the intriguing processes of thylakoid membrane biogenesis and dynamics remain unsolved. Plastoglobules, thylakoid-associated lipid droplets, appear to actively participate in thylakoid function from biogenesis to senescence. Recruitment of specific proteins enables the plastoglobules to act in metabolite synthesis, repair and disposal under changing environmental conditions and developmental stages. In the first chapter of this thesis, we review plastoglobules as thylakoid membrane microdomains and discuss their involvement in lipid remodeling during stress and in the conversion from one plastid type to another.
The second chapter is dedicated to the characterization of NAP13 (ABCI10) and -14 (ABCI11). These two proteins belong to the large ABC family. Each member of the ABCI subfamily consists of only one of the typical domains of a full ABC transporter. NAP13 and -14 encode two predicted nucleotide-binding domains. Based on earlier results (Shimoni-Shor et al. 2010), our first hypothesis was that NAP14, possibly together with NAP13, are involved in lipid translocation between PG and thylakoids. However, this thesis demonstrates that NAP13 is extrinsically associated with the chloroplast inner envelope while NAP14 cofractionated with the thylakoid membrane. Both the nap13 and -14 mutants had albino phenotypes, emphasizing essential functions in the chloroplast. Interestingly, nap13 and -14 showed similar lipid profiles but distinct from three unrelated albino mutants. The most relevant observation was their reduced level of phosphatidylethanolamine 16:0/18:3. The striking similarities shared by nap13 and -14 suggest that they contribute to the same functional pathway. We hypothesize that this may be lipid transport at the envelope rather than between PG and thylakoids.
In the third chapter, we describe the characterization of CCD4, a carotenoid cleavage dioxygenase, and its physical and functional association with PG. Fluorescence-tagged CCD4 resulted in a punctate pattern inside chloroplasts typical for PG localization in vivo. To discover the function of CCD4, a comparative lipidomics study of Arabidopsis ccd4 mutants and wild type was carried out under various conditions (light stress, senescence, Pseudomonas syringae infection). The results indicated that CCD4 is implicated in β-carotene and lutein degradation during leaf senescence. To further investigate the function of the enzyme, we engineered 35S:CCD4-YFP overexpressing lines. In conclusion, our findings indicate that β-carotene, lutein and violaxanthin are the principle substrates of CCD4 in vivo during chloroplast to gerontoplast differentiation. - PublicationAccès libreIdentification and characterization of putative Toc159 interacting partners(2015)