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Functions of RMR proteins in intracellular trafficking in the moss "Physcomitrium patens" Mitten (previously "Physcomitrella patens")
Auteur(s)
Maison d'édition
Neuchâtel
Date de parution
2021
Mots-clés
- RMR
- mousse
- vacuole
- « Physcomitrium patens » Mitten
- « Physcomitrella patens »
- ubiquitination
- E3 ligase
- phénotype
- microscopie confocale
- test « in vitro »
- stress salin
- RMR
- moss
- vacuole
- “Physcomitrium patens” Mitten
- “Physcomitrella patens”
- ubiquitylation
- E3 ligase
- phenotype
- confocal microscopy
- “in vitro” assay
- salt stress
Résumé
Dans cette étude, je me suis concentrée sur une nouvelle famille des récepteurs, appelés RMRs (Receptor-like Membrane RING-H2) et j'ai essayé d'étudier leur rôle dans la mousse <i>Physcomitrium patens</i> Mitten (précédemment <i>Physcomitrella patens</i>).<br>
Chez les Angiospermes, les protéines RMRs sont considérées des récepteurs vacuolaires pour la vacuole neutre/de stockage, un compartiment où les protéines de stockage et les métabolites s'accumulent pendant le développement des graines mais aussi dans des tissues somatiques. Elle se distingue de la vacuole lytique qui a les mêmes fonctions que les lysosomes animaux. <br>
Les cinq gènes RMRs de la mousse ont été éliminés en produisant un matériel viable sans phénotype visible (Ayachi, 2012). Un phénotype intracellulaire a été décrit par Fahr (2017) qui a généré la construction Citrine-Cardosin (Ci-Card) composée de la protéine fluorescente Citrine fusionnée au déterminant d’adressage vacuolaire C-terminal (ctVSD) de la “cardosin A” (la cardosine est adressée à la vacuole chez les plantes supérieures — Pereira <i>et al</i>., 2013). La fluorescence a été détectée dans la vacuole centrale de <i>P. patens</i> sauvage mais faussement adressée au réticulum endoplasmique chez les lignées <i>Pp</i>RMR-KO en indiquant que l’adressage à la vacuole de cette protéine dépend des <i>Pp</i>RMRs. <br>
L’introduction de cette thèse traite du système endomembranaire des plantes, avec une attention particulière au transport vacuolaire et à l'ubiquitination. <br>
Dans le deuxième chapitre, je montre les techniques utilisées pour tenter de détecter les <i>Pp</i>RMRs par immunotransfert: l’échec de détection est probablement dû à une dégradation rapide de ces protéines qui pourrait empêcher leur détection. <br>
Dans le troisième chapitre, je me suis intéressée à l'implication des <i>Pp</i>RMRs dans l'ubiquitination. Nous supposons que les <i>Pp</i>RMRs sont des E3 ligases parce qu’elles sont membres de la famille des protéines PA-TM-RING. La plupart de ces protéines ont une activité de E3 ligase chez les animaux (Seroogy <i>et al</i>., 2004; Borchers <i>et al</i>., 2002), c’est pourquoi nous avons pensé que les <i>Pp</i>RMRs pourraient également avoir cette fonction chez le plantes en contribuant ainsi au ciblage vacuolaire. <br>
Les partenaires de <i>Pp</i>RMRs étant inconnus dans la mousse, nous avons analysé des candidats en supposant qu'ils pourraient être ubiquitinés. Nous avons testé cette hypothèse par des tests d'ubiquitination par <i>Pp</i>RMR2 <i>in vitro</i>, n’obtenant que des résultats ambigus. <br>
Dans le quatrième chapitre, je montre des résultats préliminaires sur le phénotype visible de mutants KO des RMRs de la mousse : les lignées <i>Pp</i>WT et <i>Pp</i>RMR-KO ont montré des différences phénotypiques à niveau des gamétophores qui ont été accentuées lors d'une exposition au stress salin.
Enfin, j'ai transformé les lignées transgéniques <i>Pp</i>WT/Ci-Card et <i>Pp</i>5KO/Ci-Card avec des versions mutées de <i>Pp</i>RMR2, et j’ai analysé leur effet sur le transport vacuolaire par microscopie confocale. Pour la plupart des constructions testées, le trafic a été perturbé dans les deux lignées. Seule la ligne <i>Pp</i>WT/Ci-Card exprimant <i>Pp</i>RMR2ΔSer (sans le motif riche en sérine) présentait un phénotype vacuolaire sauvage typique. <br>
<b>Abstract</b><br>
In this study, I focused on a new family of receptors, called RMRs (Receptor-like Membrane RING-H2) and I tried to investigate their role in the moss <i>Physcomitrium patens</i> Mitten (previously <i>Physcomitrella patens</i>).<br>
There is some evidence that in Angiosperms, RMRs are vacuolar receptors for the neutral/storage vacuole that is a compartment where storage proteins and metabolites are accumulated during seeds development or in somatic tissues. It is distinguished from lytic vacuole which has the same functions as animal lysosomes.<br>
The five <i>Pp</i>RMR genes have been knocked-out, yielding viable material without visible phenotype (Ayachi, 2012). A trafficking phenotype was described by Fahr (2017) who generated the construct Citrine-Cardosin (Ci-Card) composed of the fluorescent protein Citrine fused to the C-terminal vacuolar sorting determinant (ctVSD) from cardosin A (cardosin is addressed to the vacuole in higher plants —Pereira <i>et al</i>., 2013). The fusion protein was delivered to the central vacuole of <i>Pp</i>WT but mistargeted in <i>Pp</i>RMR-KO lines, indicating that the targeting of this protein to the vacuole depends on <i>Pp</i>RMRs.<br>
The introduction of this thesis presents the plant endomembrane system, with particular attention to vacuolar transport and ubiquitylation.<br>
In the second chapter, I show the techniques used to attempt to detect <i>Pp</i>RMRs by Western Blot: our failure may be due to a rapid degradation of these proteins, which could prevent their detection.<br>
In the third chapter, I focused on <i>Pp</i>RMR2 involvement in ubiquitylation. We hypothesize that <i>Pp</i>RMRs are E3 ligases because they are members of the PA-TM-RING protein family. Most of these proteins have an E3 ubiquitin ligase activity in animals (Seroogy <i>et al</i>., 2004; Borchers <i>et al</i>., 2002), for this reason, we think that plant <i>Pp</i>RMRs could have this function as well, which could contribute to vacuolar targeting. Indeed, I could confirm that <i>Pp</i>RMR2 has an E3 ubiquitin ligase activity.<br>
<i>Pp</i>RMRs substrates are still unknown in moss thus we have analysed putative candidates supposing that they could be ubiquitylated by <i>Pp</i>RMRs. We have tested this hypothesis through <i>in vitro</i> ubiquitylation assays, obtaining ambiguous results.<br>
In the fourth chapter, I show preliminary results about the visible phenotype of <i>Pp</i>RMR-KO mutants: <i>Pp</i>WT and <i>Pp</i>RMR-KO lines displayed phenotypic differences in leafy gametophores, which were accentuated upon salt stress exposure.<br>
Lastly, I transformed the transgenic lines <i>Pp</i>WT/Ci-Card and <i>Pp</i>5KO/Ci-Card with mutated versions of <i>Pp</i>RMR2 and analysed their effect on vacuolar transport by confocal microscopy. For most of the constructions tested, the trafficking was perturbed in both lines. Only <i>Pp</i>WT/Ci-Card expressing <i>Pp</i>RMR2ΔSer (lacking the Serine-Rich motif) displayed a typical vacuolar pattern.
Chez les Angiospermes, les protéines RMRs sont considérées des récepteurs vacuolaires pour la vacuole neutre/de stockage, un compartiment où les protéines de stockage et les métabolites s'accumulent pendant le développement des graines mais aussi dans des tissues somatiques. Elle se distingue de la vacuole lytique qui a les mêmes fonctions que les lysosomes animaux. <br>
Les cinq gènes RMRs de la mousse ont été éliminés en produisant un matériel viable sans phénotype visible (Ayachi, 2012). Un phénotype intracellulaire a été décrit par Fahr (2017) qui a généré la construction Citrine-Cardosin (Ci-Card) composée de la protéine fluorescente Citrine fusionnée au déterminant d’adressage vacuolaire C-terminal (ctVSD) de la “cardosin A” (la cardosine est adressée à la vacuole chez les plantes supérieures — Pereira <i>et al</i>., 2013). La fluorescence a été détectée dans la vacuole centrale de <i>P. patens</i> sauvage mais faussement adressée au réticulum endoplasmique chez les lignées <i>Pp</i>RMR-KO en indiquant que l’adressage à la vacuole de cette protéine dépend des <i>Pp</i>RMRs. <br>
L’introduction de cette thèse traite du système endomembranaire des plantes, avec une attention particulière au transport vacuolaire et à l'ubiquitination. <br>
Dans le deuxième chapitre, je montre les techniques utilisées pour tenter de détecter les <i>Pp</i>RMRs par immunotransfert: l’échec de détection est probablement dû à une dégradation rapide de ces protéines qui pourrait empêcher leur détection. <br>
Dans le troisième chapitre, je me suis intéressée à l'implication des <i>Pp</i>RMRs dans l'ubiquitination. Nous supposons que les <i>Pp</i>RMRs sont des E3 ligases parce qu’elles sont membres de la famille des protéines PA-TM-RING. La plupart de ces protéines ont une activité de E3 ligase chez les animaux (Seroogy <i>et al</i>., 2004; Borchers <i>et al</i>., 2002), c’est pourquoi nous avons pensé que les <i>Pp</i>RMRs pourraient également avoir cette fonction chez le plantes en contribuant ainsi au ciblage vacuolaire. <br>
Les partenaires de <i>Pp</i>RMRs étant inconnus dans la mousse, nous avons analysé des candidats en supposant qu'ils pourraient être ubiquitinés. Nous avons testé cette hypothèse par des tests d'ubiquitination par <i>Pp</i>RMR2 <i>in vitro</i>, n’obtenant que des résultats ambigus. <br>
Dans le quatrième chapitre, je montre des résultats préliminaires sur le phénotype visible de mutants KO des RMRs de la mousse : les lignées <i>Pp</i>WT et <i>Pp</i>RMR-KO ont montré des différences phénotypiques à niveau des gamétophores qui ont été accentuées lors d'une exposition au stress salin.
Enfin, j'ai transformé les lignées transgéniques <i>Pp</i>WT/Ci-Card et <i>Pp</i>5KO/Ci-Card avec des versions mutées de <i>Pp</i>RMR2, et j’ai analysé leur effet sur le transport vacuolaire par microscopie confocale. Pour la plupart des constructions testées, le trafic a été perturbé dans les deux lignées. Seule la ligne <i>Pp</i>WT/Ci-Card exprimant <i>Pp</i>RMR2ΔSer (sans le motif riche en sérine) présentait un phénotype vacuolaire sauvage typique. <br>
<b>Abstract</b><br>
In this study, I focused on a new family of receptors, called RMRs (Receptor-like Membrane RING-H2) and I tried to investigate their role in the moss <i>Physcomitrium patens</i> Mitten (previously <i>Physcomitrella patens</i>).<br>
There is some evidence that in Angiosperms, RMRs are vacuolar receptors for the neutral/storage vacuole that is a compartment where storage proteins and metabolites are accumulated during seeds development or in somatic tissues. It is distinguished from lytic vacuole which has the same functions as animal lysosomes.<br>
The five <i>Pp</i>RMR genes have been knocked-out, yielding viable material without visible phenotype (Ayachi, 2012). A trafficking phenotype was described by Fahr (2017) who generated the construct Citrine-Cardosin (Ci-Card) composed of the fluorescent protein Citrine fused to the C-terminal vacuolar sorting determinant (ctVSD) from cardosin A (cardosin is addressed to the vacuole in higher plants —Pereira <i>et al</i>., 2013). The fusion protein was delivered to the central vacuole of <i>Pp</i>WT but mistargeted in <i>Pp</i>RMR-KO lines, indicating that the targeting of this protein to the vacuole depends on <i>Pp</i>RMRs.<br>
The introduction of this thesis presents the plant endomembrane system, with particular attention to vacuolar transport and ubiquitylation.<br>
In the second chapter, I show the techniques used to attempt to detect <i>Pp</i>RMRs by Western Blot: our failure may be due to a rapid degradation of these proteins, which could prevent their detection.<br>
In the third chapter, I focused on <i>Pp</i>RMR2 involvement in ubiquitylation. We hypothesize that <i>Pp</i>RMRs are E3 ligases because they are members of the PA-TM-RING protein family. Most of these proteins have an E3 ubiquitin ligase activity in animals (Seroogy <i>et al</i>., 2004; Borchers <i>et al</i>., 2002), for this reason, we think that plant <i>Pp</i>RMRs could have this function as well, which could contribute to vacuolar targeting. Indeed, I could confirm that <i>Pp</i>RMR2 has an E3 ubiquitin ligase activity.<br>
<i>Pp</i>RMRs substrates are still unknown in moss thus we have analysed putative candidates supposing that they could be ubiquitylated by <i>Pp</i>RMRs. We have tested this hypothesis through <i>in vitro</i> ubiquitylation assays, obtaining ambiguous results.<br>
In the fourth chapter, I show preliminary results about the visible phenotype of <i>Pp</i>RMR-KO mutants: <i>Pp</i>WT and <i>Pp</i>RMR-KO lines displayed phenotypic differences in leafy gametophores, which were accentuated upon salt stress exposure.<br>
Lastly, I transformed the transgenic lines <i>Pp</i>WT/Ci-Card and <i>Pp</i>5KO/Ci-Card with mutated versions of <i>Pp</i>RMR2 and analysed their effect on vacuolar transport by confocal microscopy. For most of the constructions tested, the trafficking was perturbed in both lines. Only <i>Pp</i>WT/Ci-Card expressing <i>Pp</i>RMR2ΔSer (lacking the Serine-Rich motif) displayed a typical vacuolar pattern.
Notes
Doctorat, Université de Neuchâtel, Institut de biologie
Identifiants
Type de publication
doctoral thesis
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