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Aragno, Michel

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Aragno, Michel
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Michel.Aragno@unine.ch
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    Anaerobic iron cycling in a neoarchean ocean analogue
    (2011)
    Walter, Xavier Alexis
    ;
    Aragno, Michel 
    The deposition of Banded Iron Formation (BIF) during the Archean and Paleoproterozoic is conventionally attributed to the precipitation of iron-oxides resulting from the abiotic reaction of ferrous iron (Fe(II)) with oxygen (Cloud, 1968). Oxygenic photosynthesis, however, appeared only around 2.7 Ga (Des Marais, 2000; Kump, 2008; Godfrey & Falkowski, 2009 ), thus raising questions as to what may have caused BIF precipitation before that time. The discovery of anoxygenic phototrophs thriving through the oxidation of Fe(II) (Widdel et al., 1993; Heisinget al., 1999) has provided support for a bacterial origin for early BIFs (Konhauseret al., 2002; Kappler et al., 20051). Despite reports of anoxygenic phototrophs that may oxidise Fe(II) in the environment (Crowe et al., 2008), a model ecosystem where photoferrotrophs are demonstrably active is still lacking (Svermann & Anbar, 2009; Johnston et al., 2009). Therefore, the ferruginous meromictic lake La Cruz (Spain) that sustains dense populations of purple and green anoxygenic phototrophic bacteria despite low sulfate and sulfide concentrations was investigated. First, the system was characterized by a physico-chemical analysis of its water column and sediments. Then we focuses on the chemocline compartment where iron oxides were found to be produced. On the one hand, We performed in situ 14C-bicarbonate incubations to detect any stimulation of autotrophy by Fe(II) addition, while on the other hand ex situ incubations were carried out with the same natural sample to detect any Fe(II) oxidation by Lake La Cruz microbiota. In parallel, we have done enrichment cultures targeting anaerobic iron oxidizing metabolisms.
    In the second chapter, we show direct evidences of a photoferrotrophic activity in the ferruginous meromictic lake La Cruz (Spain) that sustains dense populations of purple and green anoxygenic phototrophic bacteria despite low sulfate and sulfide concentrations. We observed in situ photoferrotrophic activity through stimulation of phototrophic carbon uptake in the presence of Fe(II), and quantified light-dependent Fe(II)-oxidation by the natural chemocline microbiota to assess their potential quantitative contribution to ancient BIF formation. In addition, a green photoferrotrophic bacterial consortium was enriched for the first time from a ferruginous water column. This new model ecosystem will allow testing current concepts on ancient primary productivity and its interactions with the iron- and sulphur cycles and may help to refine paleoenvironmental proxies.
    In the third chapter, our results indicate, for the first time, that nitrate-dependent chemoautotrophic iron-oxidation occurred within Lake La Cruz chemocline. The organisms responsible for this Fe(II)-oxidation demonstrated, in optimized conditions, that their Fe(II)-oxidation rate was sufficiant to oxidize the totality of the dissolved Fe(II) arriving in the chemocline compartment (21.6 - 38.4 μmol Fe(II) I-1 d-1 and 0.174 - 1.393 μmol Fe(II) -1 d-1 respectively). MPN counts for anaerobic nitrate-dependent iron-oxidizers in other stratified water columns suggest that this metabolism is more widespread than previously thought. In addition, those results support a possible participation of such metabolism to BIFs formation during the Neoarchean, once nitrates were made available after the apparition of oxygenic photosynthesis.
    In the forth chapter, the results from this study combined with those of previous studies allowed us to establish a biogeochemical model, including all the metabolisms thought to have existed in the Late Archean Ocean. Thus, Lake La Cruz illustrates how those microorganisms could have driven and shaped biogeochemical cycles during this period. Accordingly, the water column of Lake La Cruz may represent an ecotone between the two main Neoarchean Ocean compartments and, consequently, be a good model system, or samples source, for studying metabolic activity interactions in experimental conditions that reflect theoretical models of the Archean Ocean.
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    Discovery of anammox bacteria in terrestrial ecosystems
    (2011)
    Humbert, Sylvia
    ;
    Aragno, Michel 
    ;
    Zopfi, Jakob 
    Avant cette étude, le processus anammox (oxydation anaérobie de l’ammonium) était uniquement étudié dans les usines de traitement des eaux usées et dans les milieux aquatiques, sédiments inclus. Cependant, rien n'était connu encore sur la distribution, la diversité, l'abondance et l'activité des bactéries anammox dans les écosystèmes terrestres. Dans cette étude, nous apportons l’évidence, par approche moléculaire, de la présence de bactéries anammox dans les sols de zones humides, les sédiments des marais, le profil de sol d’un Reductisol, des sols de rives de lacs, un sol sur Permafrost et un aquifère poreux. L'analyse phylogénétique des séquences du gène ARNr 16S a démontrée que les bactéries anammox présentes dans les écosystèmes terrestres sont affiliées à Candidatus ‘Brocadia’, ‘Kuenenia’, ‘Scalindua’, ‘Jettenia’ and ‘Anammoxoglobus’ ainsi qu’à deux groupes non identifiés. Ces candidats anammox étaient largement distribués dans les différents environnements terrestres indiquant une plus grande diversité que dans les colonnes d’eau des milieux marins. Les bactéries anammox n'étaient pas présentes dans tous les milieux et fractions de sol échantillonnés, l’analyse démontrant leur distribution hétérogène et leurs besoins écologiques spécifiques comme la présence d’interfaces oxique / anoxique à long terme et de composés azotés inorganiques. Nous avons quantifié les bactéries anammox dans ces différents environnements en développant une nouvelle approche qPCR spécifique anammox, et leur abondance variait de 104 à 106 copies / g de sol. Finalement, le Réductisol a été sélectionné pour réaliser une analyse détaillée de l’activité anammox le long du profil de sol par des expériences d'incubation à l’isotope 15N. Pour chaque date d'échantillonnage, une production de 29N2 était observée à toutes les profondeurs du Réductisol, démontrant la présence de bactéries anammox actives. La contribution d‘anammox à la production totale de N2 était inférieure à 14%. Cette étude fournit la première preuve que les bactéries anammox sont présentes, diverses et actives dans les écosystèmes terrestres., Until this study, the anammox (anaerobic ammonium oxidation) process has been only studied in waste water treatment plants and aquatic environments, including sediments. However, nothing is known so far about the distribution, diversity, abundance and activity of anammox bacteria in terrestrial ecosystems. In this study, we provided molecular evidence for the presence of anammox bacteria in wetlands, sediments of marshes, a Reductisol profile, lake shores, a permafrost soil and a porous aquifer. Phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequences showed that anammox bacteria from terrestrial ecosystems are affiliated to Candidatus ‘Brocadia’, ‘Kuenenia’, ‘Scalindua’, ‘Jettenia’ and ‘Anammoxoglobus’, as well as two unidentified clusters. They were widely distributed in the different terrestrial environments indicating a higher diversity than in marine water column environments. Anammox bacteria were not present in every sampled environments and soil fractions demonstrating their heterogeneous distribution and their specific ecological requirements as the presence of long term oxic/anoxic interfaces and inorganic nitrogen compounds. We quantified Anammox bacteria using a new developed qPCR approach applied to the different soil environments and their abundance ranged from 104 to 106 copies/g of soil. Finally, the Reductisol has been selected for a detailed analysis of their activity along the soil profile by 15N-isotope incubation experiments. For each sampling date, production of 29N2 was observed at all depths in the soil profile demonstrating the presence of active anammox bacteria. The amount of N2 produced by anammox is less than 14% of the total N2 production. This study provides the first evidence that anammox bacteria are present, diverse and active in terrestrial ecosystems.
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    Plant and soil microbe interactions in controlled conditions: rhizosphere protozoa and bacterial community structure
    (2008)
    Roussel-Delif, Ludovic 
    ;
    Aragno, Michel 
    Plants influence the soil system by the large proportion of photosynthesized matters translocated to the roots and secreted into the soil. This root exudation provides an abundant energy source for rhizosphere living microorganisms. Plants are also strongly affected, positively and negatively, by the presence of soil microbiota, particularly bacteria, protozoa and fungi. Throughout the experiments conducted in this work, we aimed to better understand the influence of protozoa on plant growth. The first part of this work focused on the development of a microcosm method. Firstly, physical soil sterilization methods (autoclaving (A) gamma-ray irradiation (i) and both successively (AI)) were tested to eliminate the soil microbiota and their resistance form (spores and cysts). Although all sterilization methods tested were efficient to eliminate protozoa, AI was the only efficient method to eliminate aerobic heterotrophic cultivable bacteria without changing the soil pH. However the release of NH4+ in the soil after AI sterilization was higher than for other methods. Secondly, a procedure to re-inoculate the sterilized soil with a complex microbial community without protozoa was developed. The protozoa-free bacterial suspension was obtained from rhizosphere soil by subsequent filtering steps to exclude protozoa. The structure of bacterial communities characterised by 16SrDNA PCR-DGGE in the protozoa-free bacterial suspension was similar to that of the native soil. Diversity (Shannon) and evenness indexes increased with time in the sterile soil inoculated with the protozoa-free bacterial suspension. However the final bacterial community composition after 2 months of incubation in the re-inoculated soil presented a lower diversity as compared to the native soil. The second part of this work focused on the plant-microbiota interactions and on protozoa effects on plant growth. The microcosms developed in the first part of the work were re-inoculated with either sterile water or bacterial protozoa-free suspension or bacterial protozoa-free suspension and Acanthamoeba castellanii or with native soil suspension. The growth of Arabidopsis thaliana was clearly influenced by the inoculum and was particularly increased in presence of protozoa. Plants cultivated in presence of protozoa presented higher nitrogen content in leaves. The effect of leaf clipping (simulating herbivore damage) and nitrogen fertilization on soil microorganisms (bacteria, protozoa and nematodes) associated to the rhizosphere of barley was investigated in a pot experiment. The roots-shoots ratio decreased during the plant growth and was lower in the leaf clipping treatment. The abundance of bacteria was not significantly affected by leaf clipping and was higher in the high nitrogen-treatment. The abundance of bacterial-feeders (i.e. protozoa and nematodes) in the rhizosphere of 2, 4 and 6 weeks old plants was marginally affected by the nitrogen treatment as well as by leaf clipping. The role of protozoa in controlling the structure of bacterial community was investigated in the different experiment. The presence of protozoa did not change significantly the richness (numbers of bands) and the diversity (Shannon index) of the DNA-based DGGE fingerprints. The structure of the “total” bacterial communities was significantly changed in response to the functional group of protozoa (amoeba, ciliates and flagellates) inoculated as compared to the control (bacteria inoculum). The presence of protozoa did not change significantly the richness and the diversity of the RNA-based DGGE fingerprints. The structure of the active bacterial communities was significantly influenced by amoebas.
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    Rhizosphere bacterial communities associated with Lolium perenne: structuration and plant-mediated influences
    (2008)
    Jossi, Maryline
    ;
    Aragno, Michel 
    Du fait de leur présence, leur activité et leur physiologie, les racines des plantes influencent physiquement, chimiquement et biologiquement leur sol environnant. Certains microorganismes du sol vont être favorisés, ou au contraire inhibés par les racines. La rhizosphère, à la jonction entre le sol et la plante, favorise de plus une activité intense en raison de la stimulation de la microflore par la rhizodéposition et de la variété des micro-habitats. Un lien étroit existe entre les microorganismes du sol et la plante, en particulier lorsque l’on considère les plantes pérennes qui, se maintenant d’année en année au même endroit, présentent des communautés particulièrement adaptées à leur environnement. Parmi ces plantes, la graminée nitrophile Lolium perenne a été choisie dans cette étude comme plante modèle pour son abondance et son importance dans le domaine agricole en tant que plante fourragère. Les activités des microorganismes sont extrêmement diversifiées et ont un impact important au niveau de la fertilité des sols (ex : cycles des éléments nutritifs, formation et décomposition de la matière organique) et de la santé des plantes. Ces organismes constituent de ce fait le principal champ d’investigation pour le développement de bio-fertilisants et de bio-pesticides. L’impact des microorganismes et en particulier des bactéries, sur la croissance et la résistance de la plante est couramment reconnu. Les connaissances concernant l’importance des différents groupes fonctionnels bactériens de la rhizosphère, leur écologie et leur structuration, doivent cependant être enrichies afin d’améliorer la compréhension des interactions entre plantes et microorganismes dans la rhizosphère, et d’augmenter le potentiel des bio-fertilisants. Les objectifs principaux des expériences menées dans cette étude consistent à élargir les connaissances du fonctionnement de la rhizosphère, et de la structuration des communautés bactériennes. Les communautés bactériennes totales, actives et cultivables de la rhizosphère sont caractérisées en relation avec différentes perturbations (variations au niveau du génotype de la plante, modifications dues au développement de la plante, changements liés au climat global). Ceci afin de cibler les modifications spécifiques aux différentes conditions et d’identifier les populations susceptibles de tenir une place importante dans le fonctionnement de la rhizosphère et la promotion de la croissance des plantes. Toutes les approches de communautés sont réalisées dans le même sol agricole afin de conserver la contribution du sol dans le fonctionnement rhizosphérique. Les approches génotypiques des communautés bactériennes totales et actives, au champ et en serre, montrent que les influences liées à la racine affectent peu la diversité globale, et que les communautés métaboliquement actives se révèlent être plus sensibles aux perturbations liées à la plante que les communautés totales. Ce qui indique que l’influence des racines se manifeste par la prolifération, ou au contraire la mise en dormance, de populations spécifiques au sein du réservoir bactérien représenté par les communautés du sol. L’établissement, in vitro, du profil fonctionnel des populations bactériennes associées à différents cultivars (diploïdes: Cavia, Lipresso ; tétraploïdes: Anaconda, Bastion) et stades de développement de L. perenne, permet de mettre en évidence les fonctions bactériennes dont la fréquence est affectée par ces deux facteurs liés à la plante. Le cultivar Anaconda semble héberger des communautés particulièrement spécifiques. De plus, quel que soit le cultivar, le passage de la floraison de la plante semble être un stade critique, à partir duquel l’influence de la plante s’estompe et les caractéristiques des communautés rhizosphériques tendent à rejoindre celles du sol nu. Cette approche fonctionnelle est également employée pour comparer, dans l’environnement racinaire et dans le sol nu, les fréquences de certaines capacités bactériennes connues comme étant impliquées dans les interactions entre plantes et bactéries, ainsi que pour mettre en évidence les corrélations entre ces différentes capacités. La caractérisation du sol rhizosphérique des différents cultivars, ainsi que l’analyse de leurs exudats racinaires (acides organiques, composés phénoliques), mettent en évidence des différences cohérentes avec les celles observées au niveau du profil fonctionnel de leurs communautés bactériennes rhizosphériques. Une approche génotypique (au champ) des communautés bactériennes associées à L. perenne, effectuée précédemment au LAMUN, a révélé l’importance du groupe des Pseudomonas. Dans l’étude présentée ici, l’approche génotypique (au champ) ainsi que l’approche fonctionnelle (in vitro) de ces communautés mettent toutes les deux en évidence le groupe des Actinobacteria. Connu pour être particulièrement résistant aux perturbations et adapté au statut nutritionnel limité du sol. Ce groupe s’avère tenir une place importante au sein des populations actives de la rhizosphère. Il est également le principal groupe de minéralisateurs potentiel de phytate dans des conditions limitantes en P inorganique et en présence de C soluble; deux conditions fréquemment rencontrées dans la rhizosphère. Les capacités des Actinobacteria semblent être essentielles pour le maintien à long terme des environnements changeants et devraient être étudiés dans la rhizosphère avec beaucoup plus d’attention., Due to their presence, activity and physiology, plant roots influence physically, chemically and biologically their surrounding soil. Some microorganisms will be favoured, or on the contrary inhibited by roots. As the junction between soil and plant, the rhizosphere presents an intense activity because of the stimulation of microflora by rhizodeposition and of the existence of various micro-habitats. A close link exists between soil microorganisms and plants, in particular when considering perennial plants which, growing at the same place from year to year, present particularly adapted associated microbial communities. Among these plants, the nitrophilic perennial grass Lolium perenne, was choosen in this study as model plant because of its abundance, and its agricultural importance as forage plant. Microorganisms’ activities are extremely diversified and strongly implicated in soil fertility (nutrient cycling, organic matter formation and decomposition) and plant health. These organisms are therefore the main investigation field for development of bio-fertilisers and biopesticides. The impact of microorganisms, in particular of bacteria, on plant growth and resistance is currently well recognised. Knowledge about the importance of the different functional groups of bacteria in the rhizosphere, their ecology, and their structuration, have nevertheless to be enriched to improve the understanding of plant-bacteria interactions in the rhizosphere, and to increase the potential of biofertilisers. Throughout the experiments conducted in this work, the main aims are to gain additionnal knowledge about rhizosphere functionning and structuration of bacterial communities. Total, active and culturable rhizosphere bacterial communities are characterised in relation with different perturbations (plant genotype variations, modifications due to plant development, and to global climate changes), in order to target the modifications, which are specific of the different conditions, and to identify bacterial groups likely to take an important place in rhizosphere functionning and plant growth promotion. All the community approaches were conducted in the same agricultural soil in order to conserve the soil contributions in the rhizosphere functionning. Genomic approaches of total and active bacterial communities, performed in field and in greenhouse conditions in the same agricultural soil, revealed that root-mediated perturbations affect only slightly the global divesity, and that the metabolically active part of the communities was more sensitive to plant-mediated influences than the total communities. Indicating that root influence lead to the proliferation or, on the contrary, to the dormance, of specific populations among the bacterial reservoir represented by soil bacterial communities. The establishment, in vitro, of the functional profiles of bacterial populations associated with different cultivars (diploïdes: Cavia, Lipresso ; tetraploïdes: Anaconda, Bastion) and development stages of L. perenne, allows to highlight the bacterial functions presenting frequencies which are affected by these two plant-related factors. Anaconda cultivar seems to harbour particularly specific bacterial communities. Furthermore, whatever the cultivar, plant flowering appears to be a critical stage beyond which plant influence is attenuated, and characteristics of rhizosphere communities tend to gather with those of bulk soil communities. This functional approach is also used to compare, in the root environment and in the bulk soil, the frequencies of some bacterial abilities known to be implicated in plant-bacteria interactions, and to highlight the existence of correlations between these different abilities. Furthermore, the characterisation of the rhizosphere soil of the different cultivars, and the analysis of their root exudates (organic acids, phenolics), allows to highlight differences coherent with those observed on the functional profiles of their bacterial communities. A genomic approach (field conditions) of bacterial communities associated to L. perenne, performed in previous experiments, revealed the importance of the Pseudomonas group. In the present study, the genomic approach (field conditions), as well as the functional approach (in vitro) of these communities, both highlighted the Actinobacteria group. Known to be particularly resitant to perturbations and to be adapted to the poor nutrient status of the soil, this group take an important place in the key active rhizosphere populations. It is also the main group of potential phytate mineralisers under limiting inorganic P conditions and in presence of soluble C sources; two frequent characteristics of the rhizosphere environment. The abilities of Actinobacteria are thought to be essential for long term maintaning of changing environments and have to be investigated in the rhizosphere whith more attention.
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    Bacterial community associated with the rhizosphere of wheat: interactions with arbuscular mycorrhizal fungi and selection of plant growth promoting rhizobacteria for the increase of wheat growth and soil health in Indian marginal rainfed fields
    (2005)
    Roesti, David
    ;
    Aragno, Michel 
    The objective of this thesis was to improve our knowledge on the interactions between wheat, rhizobacteria and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in the mycorrhizosphere in order to define criteria for the selection of plant growth promoting bacteria (PGPR) strains in view of a PGPR/AMF dual inoculation in Indian wheat fields. First, microcosm systems were set-up to obtain mycorrhizosphere, AMF-free rhizosphere and root-free hyphosphere zones in order to examine the effects of AMF on the rhizobacterial community in the wheat mycorrhizosphere. The results showed that the bacterial community structure was more influenced by the type of rhizospheric fraction, the plant age and the plant specie than by the presence of AMF. However, the bacterial community was affected indirectly by AMF via a modification in the soil pH. In addition, there was a strong increase in the proportion of phosphate solubilizing bacteria in AMF related zones probably resulting from soluble phosphorus depletion in consequence to AMF phosphorus uptake. Secondly, spores of the arbuscular mycorrhizal fungi Glomus geosporum and G. constrictum were harvested from single spore derived pot cultures with either Plantago lanceolata or Hieracium pilosella as host plants to determine if specific bacterial populations were associated with AMF spores. The bacterial communities associated with the spores were more influenced by the AMF than by the host plant. The majority of the bacterial sequences that were common to both G. geosporum and G. constrictum spores were affiliated to taxonomic groups known to degrade biopolymers. These bacteria were probably feeding on the spore's outer hyaline layer. The third part of the study examined how PGPR strains directly affected AMF growth in the hyphosphere. An in vitro device, consisting of a two-compartmental Petri plate system using Ri T-DNA transformed clover roots permitting the separation of the hyphosphere from the mycorrhizosphere, was designed and tested. Even though the PGPR strains tested were all DAPG producers, their effects on the AMF development varied from inhibition to improvement of the hyphal biomass or spore production. For the fourth part of the study, we had to ensure that before applying the selected PGPR strains P. jessenii R62 and P. synxantha R81 in the fields, they were able to colonize the rhizosphere in situ. They were marked with the green fluorescent protein before testing them in greenhouse pot experiments. R62gfp had colonized the root at a later stage than R81gfp, explaining why the PGP effect of R62gfp was delayed. Both gfp strains were located in the upper part of the root but R81gfp was also detected near the root elongation zone. The fifth part was undertaken in the fields to confirm the positive interactions between AMF and the PGPR strains R62 and R81 and to assess the changes in the wheat bacterial rhizospheric community with respect to field conditions, plant age and PGPR/AMF bio-inoculation. As compared to the bacterial community of the rhizoplane/endorrhizosphere, the bacterial community of the root-adhering rhizospheric soil was more influenced by the field conditions such as an increase in fertilizer input. The bacterial community structure was also dependent on the plant's growth stage. In addition, the type of PGPR consortium had a greater impact on the bacterial community structure than the mycorrhizal colonization. The treatment composed of R62/R81 and an indigenous AMF consortium had not only a positive but also in some aspects, a synergistic effect on plant development.
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    How white lupin can survive in soils with sparingly available phosphate: cluster root secretion physiology and plant microbe interactions
    (2005)
    Weisskopf, Laure
    ;
    Martinoia, Enrico
    ;
    Aragno, Michel 
    Au cours de l'évolution, les plantes ont développé différentes stratégies pour survivre sur les sols où le phosphate est peu disponible. L'une d'entre elles est la formation de structures racinaires particulières, que l'on appelle racines protéoïdes ou " cluster roots ". Presque toutes les plantes de la famille australienne des Protéacées développent ces racines, alors qu'on les observe seulement à titre d'exception chez les autres espèces. Le lupin blanc, Lupinus albus L., notre plante modèle, est une telle exception. Cette légumineuse annuelle est la seule espèce d'importance agronomique qui forme des racines protéoïdes. Les racines protéoïdes du lupin blanc sécrètent de grandes quantités d'acides organiques, surtout du citrate et du malate, et provoquent simultanément une acidification de la rhizosphère. Cette sécrétion et acidification se déroulent à un stade bien particulier du développement des racines protéoïdes, le stade " mature ". Dans le travail qui suit, nous avons étudié la sécrétion racinaire à différents stades de développement des racines protéoïdes du lupin blanc ainsi que l'influence de cette sécrétion racinaire sur la microflore rhizosphérique. Nous avons caractérisé les isoflavonoïdes produits et excrétés dans les racines protéoïdes en croissance. Les isoflavonoïdes les plus importants étaient la génistéine et l'hydroxygénistéine, ainsi que leurs conjugués glycosylés. Alors qu'aucun changement n'a pu être observé dans les contenus internes d'isoflavonoïdes durant le développement des racines protéoïdes, la sécrétion de ces composés, elle, variait en fonction du stade de développement, avec la plus forte sécrétion dans les jeunes racines et les racines prématures. Une modification importante de cette sécrétion d'isoflavonoïdes par les jeunes pousses de lupins a été observée lorsque les graines avaient germé en présence de bactéries ou de champignons. Cette réaction à la présence de micro-organismes lors de la germination était spécifique à la souche de bactérie ou de champignon utilisée. Nous avons également investigué l'impact de la sécrétion des racines protéoïdes du lupin sur les communautés microbiennes de la rhizosphère. Nos résultats ont montré que les communautés bactériennes étaient influencées par l'activité de sécrétion des racines protéoïdes : le stade mature des racines protéoïdes était caractérisé par une plus faible abondance de bactéries (cultivables et totales), ainsi qu'une moins grande richesse (profils DGGE). Environ 50 % des populations bactériennes isolées du stade mature des racines protéoïdes était capables de pousser sur des milieux à bas pH (4), alors que seuls 20 % des populations isolées du stade juvénile pouvaient faire de même, ce qui suggère que la baisse de pH qui se produit de manière temporaire dans la rhizosphère des racines protéoïdes matures pourrait être la cause de la baisse d'abondance bactérienne observée précisément à ce stade. En revanche, aucun effet inhibiteur des isoflavonoïdes excrétés par le lupin blanc n'a pu être observé in vitro sur la croissance des bactéries. Ces isoflavonoïdes ont provoqué une réaction uniquement chez certains champignons, dont la sporulation a été stimulée. Des activités de type PGPR (plant growth promoting rhizobacteria) ont aussi été testées sur les souches isolées de la rhizosphère des racines protéoïdes du lupin blanc et les résultats ont suggéré que la production d'auxine par les bactéries pourrait être impliquée dans la formation des racines protéoïdes. De plus, la fixation associative d'azote a été analysée par des méthodes de " fingerprinting " sur la base de fragments du gène nifH amplifié à partir des ADN et des ARN extraits de différents stades des racines protéoïdes. Aucune amplification n'a été observée pour les racines protéoïdes matures, alors que l'amplification a été possible pour les juvéniles et les sénescentes à partir d'ADN et également à partir d'ARN dans un cas, ce qui laisse penser que la fixation associative d'azote pourrait avoir lieu dans la rhizosphère des racines protéoïdes, en plus de la fixation symbiotique dans les nodules, qui se forment en général sur les racines non protéoïdes. Le phosphore est un des éléments majeurs qui limitent les rendements de l'agriculture dans bien des régions du monde et le lupin blanc pourrait être une plante prometteuse à cet égard, puisqu'il est capable à la fois d'acquérir le phosphate en produisant des racines protéoïdes et de fixer l'azote en association avec des bactéries symbiotiques. A l'issue de ce travail, nous avons acquis une compréhension plus approfondie du fonctionnement des racines protéoïdes et des interactions entre la plante et les micro-organismes de la rhizosphère. Ces connaissances pourront, je l'espère, être transférées du laboratoire à la situation concrète de la culture au champ
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    Réponse des populations de "Pseudomonas" à une augmentation de la concentration de CO2 atmosphérique dans la rhizosphère de "Lolium perenne" et "Molinia coerulea"
    (2004)
    Tarnawski, Sonia
    ;
    Aragno, Michel 
    Cette thèse a pour objectif d'évaluer la réponse des Pseudomonas à une augmentation de la concentration en CO2 atmosphérique (pCO2) dans la rhizosphère de deux graminées pérennes: Lolium perenne et Molinia coerulea. La première partie de ce travail s'intéresse au développement d'outils méthodologiques pour l'étude de la diversité des Pseudomonas dans le sol et la rhizosphère. Nous avons mis au point un protocole d'amplification d'une partie de l'ADNr 16S et de l'intergène 16S-23S de l'ADNr (séquences 16S-ITS1) spécifique au genre Pseudomonas. L'analyse PCR-RFLP des séquences d'ADNr 16S-ITS1 a ensuite été utilisée pour la caractérisation des populations de Pseudomonas associées à la rhizosphère de M. coerulea par approche culturale et amplification directe des séquences 16S-ITS1. Les Pseudomonas représentaient jusqu'à 10% de la microflore cultivable du sol et de la rhizosphère, et leur diversité était plus faible dans la fraction racinaire que dans le sol. Les Pseudomonas fluorescents dominaient dans la fraction racinaire alors que des organismes proche de P. alcaligenes étaient plus fréquemment retrouvés dans le sol. La seconde partie de cette étude est consacrée à l'influence d'une augmentation du pCO2 sur les populations de Pseudomonas associés à la rhizosphère des graminées pérennes. L'analyse de caractères en relation avec la plante (production d'auxine, sidérophores, de cyanure d'hydrogène, et réduction des nitrates) de 1228 isolats montrait que la structure phénotypique des populations de Pseudomonas était altérée sous fort pCO2 dans la rhizosphère, les deux plantes influençant différemment leur microflore. La fréquence des Pseudomonas réducteurs de nitrate était stimulée sous pCO2 élevée avec la proximité de la racine. La diversité génotypique des Pseudomonas dissimilant les nitrates, basée sur l'analyse des séquences ITS1, et des gènes de nitrate réductase narG et napA n'était pas significativement modifiée sous pCO2 élevée ou à proximité de la racine. Les Pseudomonas réducteurs de nitrates semblaient contre-sélectionnés dans la rhizosphère de L. perenne, et limités dans leur réponse au pCO2 élevée par la disponibilité en azote. L'étude des formes de nitrate réductases présentes dans les souches correspondantes, a révélé une modification de la diversité fonctionnelle parmi les souches de Pseudomonas associés à la rhizosphère sous pCO2 élevée. Ce changement dans les populations de Pseudomonas est discuté en relation avec les possibles modifications des conditions physico-biochimiques de la rhizosphère sous fort pCO2., The objective of this thesis was to assess the response of Pseudomonas to an increase atmospheric CO2 concentration (pCO2) in the rhizosphere of the two perennial grasses: Lolium perenne and Molinia coerulea. The first part of this work was interested in the development of methodological tools for studying Pseudomonas diversity in the soil and in the rhizosphere. We proposed a protocol for the specific Pseudomonas amplification of the partial 16S rDNA and 16S-23S rDNA spacer (16S-ITS1 sequences). PCR-RFLP analysis of 16S-ITS1 rDNA sequences was used for the characterization of Pseudomonas associated with the rhizosphere of M. coerulea by culture approach and direct amplification of the 16S-ITS1 sequences. Pseudomonas accounted for up to 10% of the cultivable microflora in soil and rhizosphere, and its diversity was lower in the root fraction. Fluorescent Pseudomonas dominated in the rhizosphere whereas organisms close to P. alcaligenes were more frequently found in the soil. The second part this study was devoted to the influence of an increase in pCO2 on Pseudomonas populations associated with the rhizosphere of the perennial grasses. Analysis of characters in relation with the plant (auxin, siderophores, hydrogen cyanide production and nitrate reduction) among 1228 isolates showed that the phenotypic structure of Pseudomonas populations was altered under elevated pCO2 in the rhizosphere, the two plants influencing their microflora differently. Nitrate reducers Pseudomonas were stimulated under elevated pCO2 at the root proximity. The genotypic diversity of nitrate dissimilating Pseudomonas, based on 16S-ITS1 rDNA sequences and narG and napA nitrate reductase genes analysis, was not significantly modified by plant or by elevated pCO2. Nitrate reducing Pseudomonas seemed to be counter-selected in the rhizosphere of L. perenne, and limited in their response to elevated pCO2 by nitrogen availability. The study of nitrate reductase forms present in the corresponding strains revealed a modification of functional diversity among rhizospheric Pseudomonas under elevated pCO2. This change among Pseudomonas populations is discussed in relation with possible modifications of the rhizosphere physico-biochemical conditions under elevated pCO2.
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    Influence d'une augmentation en pCO2 atmosphérique sur les communautés bactériennes associées à Molinia coerulea
    (2003)
    Hamelin, Jérôme
    ;
    Aragno, Michel 
    La thèse traite de l'influence de l'augmentation de la teneur en dioxide de carbone de l'atmosphère observée depuis un siècle sur terre. Nous avons postulé que l'augmentation en CO2 atmosphérique modifierait en premier lieu les microorganismes du sol situés à proximité des racines, car cela altérerait la quantité et la qualité des exsudats racinaires. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux communautés bactériennes associées au système racinaire des graminées pérennes. En effet, ces plantes sont particulièrement intéressantes dans ce contexte car d'une part, elles poussent au même endroit d'une année à l'autre et d'autre part, les graminées sont connues pour allouer une grande part des produits de la photosynthèse dans l'interface sol-racine, nommée rhizosphère. La plante modèle choisie est Molinia coerulea (la canche bleue), une graminée pérenne hémicryptophyte qui pousse naturellement dans des sols ayant très peu d'azote disponible (sols à nappe battante, tourbières). Nous pensons que l'écologie et la physiologie même de cette plante en fait une candidate idéale pour réagir à une augmentation en CO2 atmosphérique. Le manuscrit suit trois axes principaux correspondant aux trois grands thèmes menés en parallèle: La première partie s'intéresse aux communautés microbiennes dans leur ensemble. Nous avons particulièrement orienté nos efforts sur l'interprétation statistique des empreintes moléculaires (fingerprint). Ces fingerprints sont basés sur la séparation éléctrophorétique en gel avec gradient de dénaturation (DGGE) du gène ribosomique 16S. Des indices de diversité spécialement adaptés aux fingerprints ont été mis au point pour permettre une meilleure interprétation des profils. Les méthodes d'ordination (AFC et ACC) appliquées à ces profils moléculaires ont permis de mettre en exergue des populations de d-protéobactéries plus abondantes près des racines lorsque les plantes étaient cultivées sous une atmosphère enrichie en CO2. De même, on a repéré des populations d'actinomycètes peu abondantes mais actives dans le sol dans ces mêmes conditions de culture. La technique Biolog nous a permis de montrer que les communautés bactériennes de la rhizosphère, et non celles du sol distant des racines, réagissaient à une augmentation de la teneur en CO2 atmosphérique. Les hydrates de carbones sont en particulier plus facilement consommés sont par les communautés racinaires sous atmosphère enrichie. La deuxième partie de mon doctorat a concerné les populations du genre Pseudomonas. Nous avons d'abord mis au point un outil de caractérisation de la diversité spécifique à ce genre, puis nous avons caractérisé cette diversité dans la prairie naturelle. Enfin, nous avons comparé les Pseudomonas réducteurs de nitrate (première étape de la dénitrification) sous atmosphère enrichie et sous atmosphère ambiante. La troisième partie du travail est consacrée aux bactéries fixatrices d'azote (BFN). Nous avons choisi comme marqueur moléculaire le gène nifH (codant pour la nitrogénase réductase, l'enzyme clé de la nitrogénase) pour suivre la guilde des BFN dans l'environnement racinaire. Le résultat le plus frappant a été la mise en évidence d'un groupe de BFN non-cultivables qui représentaient 58% des BFN dans l'environnement naturel de Molinia coerulea. Les BFN semblent présentes aussi bien dans les racines que dans le sol environnant, mais la fixation d'azote semble s'effectuer uniquement dans la racine (détection des transcrits des gènes nifH). Nous en avons conclu que le sol pouvait servir d'habitat et de réservoir aux BFN mais que c'était la racine qui constituait le véritable siège de la fixation d'azote dans notre système., The thesis deals with the influence of the rising of the atmospheric carbon dioxide content observed on earth since one century. We postulated that the global changes would first alter the soil organisms located near the roots because of a modification of the quantity and quality of root exudates with an elevation of CO2 content. We focused on the microbial communities living near the roots of perennial grasses. They are particularly interesting because they grow at the same place from one year to an other and grasses are known to allocate an especially huge amount of photosynthesis derived carbon in the soil-root interface, called the rhizosphere. The model plant studied is Molinia coerulea, an hemicryptophytic perennial grass, naturally occurring in available nitrogen poor soil. We postulated that its physiology allow to react to an increase of atmospheric CO2 content. The manuscript followed three main axes. The first part deals with the microbial communities taken as a whole. A special effort has been intended in the statistical interpretation of 16S rDNA DGGE fingerprinting profiles. New diversity indices were designed to better interpret the profiles. Ordination methods (CA and CCA) were successfully applied: active delta-proteobacteria populations were highlighted near the roots under elevated CO2 conditions and non-dominant but active actinobacteria were characteristic of the soil environment. The physiological status of the bacterial communities has been studied using BIOLOG plates. As expected, the bacterial root community under elevated CO2 better metabolized the carbohydrates than the control one. The second part of the manuscript focused on the Pseudomonas genus. We first described the diversity of the Pseudomonas present in the natural conditions were Molinia coerulea is found. We showed an increase of the nitrate reducing Pseudomonas under elevated CO2 content. The third part of the manuscript targeted the nitrogen-fixing bacteria (NFB) in the rhizospheric environment. We used the nifH gene (encoding for the catabolic unit of the dinitrogenase reductase) as molecular marker to follow the guild of NFB. The most striking result is the dominance of an uncultured group of NFB in the natural condition detected by molecular methods. Working on nifH mRNA leads to an other important result. The NFB seems to be either present in soil and root environments but the NFB were only active near the roots. We concluded that the soil could be a reservoir of NFB and the root itself could be considered as the niche for NFB.
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    Advances in biological tracer techniques for hydrology and hydrogeology using bacteriophages: Optimization of the methods and investigation of the behavior of bacterial viruses in surface waters and in porous and fractured aquifers
    (1994)
    Rossi, Pierre
    ;
    Aragno, Michel 
    ;
    Muller, Imre 
    This work was undertaken in the Laboratoire de Microbiologie of the University of Neuchâtel, in close collaboration with the Center of Hydrogeology (CHYN). This multi-disciplinary research project was instigated because of the growing need both for environmentally harmless hydrogeological investigation tools, and for new tracers that can be used in multitracing experiments. This work treats of the use of bacteriophages as biological tracers in underground and surface waters. The size of bacteriophages is of the order of a few hundred nm. These viruses only attack specific bacteria. They are absolutely harmless for any other living organism. Previous experiments have shown the value of bacteriophages as tracers in fissured environments. The aims of the present work were: to select several bacteriophages particularly well adapted to the use as hydrogeological tracers ; to optimize the production of these bacteriophages, and the analytical methods for detecting them; to study the behavior of these bacteriophages experimentally, under different physico-chemical conditions; to test the phages in karstic fissured environments and to extend their use to saturated porous environments and surface hydrology; to compare the migration of these phages to that of the best conventional hydrological tracers. The first part of this work treats of the isolation and characterization of new bacteriophages. Over twenty bacteriophage/host bacterium (BHB) systems were studied. Seven bacteriophages were selected for the second part of the project. The selection was based on the physiological properties of the host bacteria and the physico-chemical characteristics of the bacteriophages. These seven phages exhibit an interesting variety of shapes and physical characteristics. They include three phages of strictly marine bacteria. None of these BHB systems are naturally found in aquifer waters. The rest of this work includes the development of an analytical and enumeration technique. We chose to work with the double agar-layer technique, using Petri dishes. The growth media and the different steps of this technique were optimized for each BHB system. This increased the reliability and reproducibility of the technique, without adding to the cost or workload. The behavior of the phages was studied in laboratory experiments. As this behavior is mostly determined by the inactivation and adsorption of the phages, we investigated the influence on these two phenomena of various parameters, either physical (temperature, pH, agitation), or chemical (ionic concentrations, presence of proteins, of sand or colloidal clay particles). Our results show that in water, phages react very rapidly and massively to the presence of colloidal particles, even to very low concentrations. Agitation causes the viruses to be rapidly inactivated. Raising the temperature increases this inactivation. Colloidal clay particles (Montmorillonite and Attapulgite) as well as organic macromolecules efficiently protect the phages from inactivation. Only one phage was inactivated faster in the presence of mineral colloids. Each phage reacted individually to the presence of these mineral colloids. However, no correlation could be established with the physico-chemical characteristics of the bacteriophages. The reactions can be classified into three distinct types, described by Grant et al. [1993]. According to the type of reaction of a phage, it is possible to qualitatively predict its behavior during a tracing experiment. The tracing experiments performed in karstic fissured environments showed that the migration of bacteriophages is similar to that of the best fluorescent tracers (Uranine, Sulphorhodamine). The restitutions are generally high. The phages always reappear faster, which shows that they can be diluted more, before reaching their inferior detection limit. The trials performed in a porous saturated environment, on the Wilerwald (CH) test site, showed that bacteriophages are also adapted to this type of conditions. Their speed of migration is higher than that of dissolved chemical compounds (Uranine, Naphtionate). Only one trial was performed in a river. It nevertheless showed that phages are also perfectly suitable to these types of tracings. By the simultaneous injection of several bacteriophages at different points along the river, it was possible to scan its course and discover an infiltration zone. This work confirms that phages are of undeniable value to hydrology as biological tracers. Their impact on the environment is practically nil and they can therefore be used also in delicate situations (springs used for drinking water, tracings in inhabited areas). This method is not limited to karstic aquifers anymore. Our modifications and adaptations of the technique make it suitable also for saturated porous environments and rivers. It advantages are numerous: The phages are non-pathogenic, non-toxic and invisible. So this method can also be used for studying drinking water (springs, reservoirs, etc). Each phage generally attacks only one bacterial species. By a careful selection of the BHB systems, any effect on the aquifers microflora can be avoided. No background noise exists in the aquifers, since they phages are not found there naturally. None will be generated or will persist over time, because of their short life span. The analysis of the samples is fast and cheap. Only a few milliliters of water are necessary for the enumeration of the phages. The detection level of the routine-analysis technique is about 1 phage per 2 ml of water. This sensitivity is comparable, and most often superior, to that of the best fluorescent tracers. If need be, the sensitivity can be lowered to 1 phage per 10 ml. It is also possible to differentiate and count a mixture of phages in a single sample. Theoretically, bacteriophages offer unlimited possibilities of multitracings. Ten to twenty liters of phage culture are necessary for one tracing experiment. Such an amount is easily transportable, even to inaccessible injection sites. It will contain 1014 - 1015 phages, which represents in all about 1 gram of protein and a few grams of mineral salts and of various organic substances (amino acids, growth medium components). The influence on the aquifer will be negligible, even if the flow is small.