Modular Metabolites from Nematodes: Combining Analytical Techniques and Synthesis

Les nématodes représentent le groupe d’animaux le plus abondant sur Terre, occupant pratiquement tous les écosystèmes et exploitant une grande diversité de sources alimentaires. Ils produisent un grande nombre de signaux moléculaires qui régissent les communications intra-organismique ainsi que intra- et inter-espèce. Des recherches récentes ont permis de caractériser plusieurs grands groupes de molécules de signalisation dérivées des nématodes, notamment les ascarosides,1 les N-acyl éthanolamines (NAEs),2 les némamides,3 les glucosides modulaires,4 les maradolipides5, entre autres. Même de faibles variations structurelles au sein de ces molécules de signalisation peuvent modifier considerablement leur fonction biologique, ce qui motive des efforts continus pour identifier et annoter de nouveaux métabolites des nématodes ainsi que pour élucider leurs voies biosynthétiques. L’élucidation structurale des métabolites de nématodes repose traditionnellement sur une combinaison de chromatographie, de spectrométrie de masse et de spectroscopie de résonance magnétique nucléaire unidimensionnelle et bidimensionnelle. Cette thèse présente la découverte, l’isolation et l’élucidation structurale de nouveaux métabolites modulaires dérivés de nématodes, ainsi que des informations inédites sur les gènes impliqués dans leur biosynthèse.

Une analyse comparative du métabolome de Caenorhabditis elegans a conduit à l’identification d’une famille nouvelle et conservée de glucosyl-glycéroyol-N-acyl phosphoéthanolamines (GGP-NAEs). Ces composés consistent en une unité de 𝛽-glucose liée à un squelette glycérol–phosphate–éthanolamine portant des chaînes homologues N-acyles variables en longueur et en fonctionnalisation (par exemple, cyclopropyle, hydroxy, céto et doubles liaisons). L’élucidation structurale complète de GGP-NAE20:5 (47), GGP-NAE18:5 (50), GGP-NAE15:1cyclo (51) et GGP-NAE16:0-3-OH (52) par MS/MS et RMN a confirmé les structures proposées précédemment par Artyukhin et al.6 et a révélé des intermédiaires biosynthétiques impliquant le cycle de 𝛽-oxydation peroxysomal dans le raccourcissement des chaînes N-acyles. Des GGP-NAEs supplémentaires contenant des groupes cyclopropyle et des chaînes iso-ramifiées ont montré que C. elegans incorpore des chaînes N-acyles provenant à la fois du régime alimentaire bactérien et de la lipogenèse de novo. Des expériences de jeûne ont en outre démontré une diminution des GGP-NAEs mono- et polyinsaturés chez C. elegans. Les GGP-NAEs sont conservés au sein de la famille des Caenorhabditis et ont été détectés en quantités variables chez Caenorhabditis briggsae et 15 autres espèces de Caenorhabditis.

Un second projet a permis de caractériser fonctionnellement le gène C. elegans kat-1 comme une 2-méthylacetoacétyl-CoA thiolase mitochondriale responsable du clivage du (S)-2-méthyl-3-oxobutyroyl-CoA (104) en acétyl-CoA (105) et propionyl-CoA (106). Un marquage isotopique stable utilisant la L-isoleucine [U-13C6,15N] a conduit à la découverte de nombreux nouveaux glucosides modulaires substitués par le tigloyl enrichis en kat-1, dont plusieurs ont été validés structurellement par spectroscopie RMN. Cette expérience de marquage a également révélé des intermédiaires dépendants de kat-1 du métabolisme de la L-isoleucine, incluant des acides libres à chaîne C5 anteiso-ramifiée et leurs L-carnitines C5 correspondantes, ce qui a permis de proposer une voie biosynthétique pour la formation du glucoside tigloyl.

Un troisième projet a consisté en la première étude métabolomique de l’extrêmophile Halicephalobus mephisto, qui a permis d’identifier des ascarosides conservés et spécifiques à l’espèce. Le criblage UHPLC-HR-MS visant un ion marqueur diagnostique à m/z 73,02 [C3H5O2]− a confirmé la présence des ascarosides conservés tels que asc-C4 (ascr#11 (132)), asc-C5 (ascr#9 (133)), asc-𝜔C6 (oscr#12 (134)) et asc-C7 (ascr#1 (2)), et a révélé six nouveaux ascarosides putatifs spécifiques à l’espèce. La validation synthétique des dérivés aroylés proposés de asc-C5 concernant le produit naturel 2-benzoyl-asc-C5 (166) a montré que le substituant aroyl se situe en position 2 plutôt qu’en position 4 de l’unité L-ascarylose. Des structures pour 3 autres ascarosides acylés C8 ont été proposées sur la base de l’analyse de leurs spectres de fragmentation MS/MS. Cependant, la synthèse du 4-subéroyl-asc-C5 (137) n’a pas permis de confirmer l’identité du produit naturel A, et les résultats du marquage isotopique mixte étaient non concluants, de sorte que leurs structures restent non identifiées.

En résumé, ce travail identifie la famille conservée des GGp-NAEs dans 17 espèces de nématodes, caractérise pleinement quatre représentants, annote la fonction de kat-1 et élargit la diversité connue des glucosides modulaires. Il fournit également la première analyse métabolomique complète de H. mephisto, démontrant sa production à la fois d’ascarosides canoniques et spécifiques à l’espèce, dont plusieurs ont été structurellement élucidés.

Nematodes represent the most abundant group of animals on Earth, occupying nearly all ecosystems and exploiting diverse food sources. Interestingly, they produce a wide array of small-molecule signals that mediate intra-organismal as well as intra- and inter-species communication. Recent research has characterised several major groups of nematode-derived signalling molecules, including ascarosides,1 N-acyl ethanolamine,2 nemamides,3 modular glucosides,4 maradolipids5 among others. Even minor structural variations within these signalling molecules can dramatically alter their biological function, motivating extensive efforts to identify and annotate nematode metabolites and their biosynthetic pathways. The structure elucidation of nematode metabolites has traditionally been performed by using a combination of chromatography, mass spectrometry and one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy. This PhD thesis reports the discovery, isolation, and structure elucidation of novel nematode-derived modular metabolites, as well as insights into the genes involved in their biosynthesis.

Comparative metabolomic analysis of the Caenorhabditis elegans metabolome led to the identification of a previously uncharacterised, conserved family of glucosyl-glyceroyl-N-acyl phosphoethanolamines. These compounds consist of a 𝛽-glucose unit linked to a glycerol-phosphate-ethanolamine backbone bearing diverse homologous N-acyl chains that vary in length and functionalisation (e.g., cyclopropyl, hydroxy, keto, and double bonds). Full structural elucidation of GGP-NAE20:5 (47), GGP-NAE18:5 (50), GGP-NAE15:1cyclo (51), and GGP-NAE16:0-3-OH (52) using MS/MS and NMR confirmed structures previously proposed by Artyukhin et al.6 and revealed biosynthetic intermediates that implicate the peroxisomal 𝛽-oxidation cycle in N-acyl chain shortening. Additional cyclopropyl-containing and iso-branched GGP-NAEs showed that C. elegans incorporates N-acyl chains from both the bacterial diet and de novo lipogenesis, respectively. Starvation experiments further demonstrated a decrease in mono- and polyunsaturated GGP-NAEs in C. elegans. The GGp-NAEs are conserved across the Caenorhabditis family and have been detected in variable amounts in Caenorhabditis briggsae and 15 additional Caenorhabditis spp.

A second project functionally characterised the C. elegans kat-1 gene as a mitochondrial 2-methylacetoacetyl-CoA thiolase responsible for cleaving (S)-2-methyl-3-oxobutyroyl-CoA (104) into acetyl-CoA (105) and propionyl-CoA (106). Stable isotope labelling using [U-13C6,15N]-L-isoleucine enabled the discovery of numerous kat-1 enriched novel tigloyl-substituted modular glucosides, several of which were structurally validated by nuclear magnetic resonance spectroscopy. The labelling experiment also revealed kat-1-dependent intermediates of L-isoleucine metabolism, including free anteiso-branched C5-acids and their corresponding C5-L-carnitines, allowing the proposal of a biosynthetic pathway for the tigloyl glucoside formation.

In a third project, the first metabolomic investigation of the extremophile Halicephalobus mephisto identified both conserved and species-specific ascarosides. UHPLC-HR-MS screening for a diagnostic marker ion at m/z 73.02 [C3H5O2]− confirmed conserved ascarosides such as asc-C4 (ascr#11 (132)), asc-C5 (ascr#9 (133)), asc-𝜔C6 (oscr#12 (134)) and asc-C7 (ascr#1 (2)) and revealed six new species-specific putative ascarosides. Synthetic validation of the proposed aroylated asc-C5 derivatives for the natural product 2-benzoyl-asc-C5 (166) demonstrated that the aroyl substituent resides at the 2-position rather than the 4-position of the L-ascarylose unit. Structures for 3 additional C8-acyl ascarosides were proposed based on analysis of their MS/MS fragmentation spectra. However, synthesis of 4-suberoyl-asc-C5 (137) could not confirm the identity with the natural product A and results from mixed isotope labelling were inconclusive, so that their structures remained unidentified.

Overall, this work identifies the conserved GGp-NAE family in 17 nematode species, fully characterises four representatives, annotates the function of kat-1, and expands the known diversity of modular glucosides. It also provides the first comprehensive metabolomic analysis of H. mephisto, demonstrating its production of both canonical and species-specific ascarosides, several of which were structurally elucidated.

Jury :
• Prof. Stephan von Reuss, directeur de thèse, Université de Neuchâtel, Suisse
• Dr Gaétan Glauser, Université de Neuchâtel, Suisse
• Prof. ém. Reinhard Neier, Université de Neuchâtel, Suisse
• Prof. Frank C. Schroeder, BTI, Cornell University, USA

No de thèse : 3231