ABA-dependent differential regulation of chloroplast protein import pathways during the seed-to-seedling transition

La biogenèse des chloroplastes définit la transition des proplastides non photosynthétiques vers les chloroplastes photosynthétiquement actifs dans les cellules embryonnaires des graines en germination (“transition de la graine à la plantule”). C'est la clé de la croissance photoautotrophe des plantes. Le chloroplaste a besoin d'environ 2500 protéines codées par le noyau pour fonctionner. Celles-ci sont synthétisées dans le cytoplasme sous forme de préprotéines avec un peptide de transit N-terminal. Au cours de la biogenèse du chloroplaste, deux classes de préprotéines, à savoir celles associées à la photosynthèse et celles non associées à la photosynthèse, sont importées par des translocons au niveau des membranes externe et interne du chloroplaste, appelées respectivement TOC et TIC. Deux types de complexes TOC existent et accueillent les préprotéines respectives. Ils sont trimériques et composés de TOC159, TOC33, TOC75 (appelé pTOC pour les protéines associées à la photosynthèse) ou de TOC132/-120, TOC34 et TOC75 (appelé nTOC pour les protéines non associées à la photosynthèse). TOC159 et TOC33 (ainsi que leurs homologues TOC132/-120 et TOC34) contiennent des domaines GTPase et jouent un rôle dans la reconnaissance des préprotéines. Ils s'assemblent avec la protéine “β-barrel” TOC75, ce qui donne un translocon trimérique fonctionnel. Notamment, le domaine C-terminal de TOC159 (ainsi que TOC132/-120 selon les prédictions) adopte également une structure β-barrel et, avec celui de TOC75, s'assemble en canal hybride. La germination des graines est favorisée par l'hormone végétale acide gibbérellique (GA) et régulée négativement par l'acide abscissique (ABA). Cependant, la manière dont ces hormones, et en particulier l'ABA, influencent la biogenèse des chloroplastes et sa synchronisation avec le développement de la plante est encore mal comprise. Dans cette étude, j’ai tout d’abord examiné les effets globaux de 0,5 μM d’ABA sur le protéome et le transcriptome de plantules âgées de 36 heures, en utilisant les approches RNA-seq et la spectrométrie de masse. J’ai ensuite analysé différentes concentrations d’ABA sur des plantules âgées de 72 heures afin de valider les résultats omiques, en portant une attention particulière aux composantes TOC et TIC ainsi qu’à leurs substrats. L’expression des ARNm et l’accumulation des protéines ont été évaluées par PCR en temps réel et par western blot, dans le but d’élucider les mécanismes régulateurs sous-jacents. Mon analyse RNA-seq à l'échelle du transcriptome indique la régulation à la baisse des termes GO liés à la photosynthèse et la régulation à la hausse des termes GO non liés à la photosynthèse/au stress en réponse au traitement par l'ABA. L'analyse des protéines à l'échelle du protéome a révélé que la plupart des protéines correspondantes présentaient un comportement similaire. Sous ABA également, les composants du pTOC ont été régulés à la baisse, tandis que ceux du nTOC ont été régulés à la hausse au niveau des protéines. Cependant, les niveaux d'ARN du pTOC et du nTOC étaient en hausse. Les données indiquent que l'ABA réprime la biogenèse du chloroplaste par une régulation spécifique à la baisse des protéines associées à la photosynthèse ainsi que des composants du pTOC, tandis que les protéines non associées à la photosynthèse/au stress sont régulées à la hausse ainsi que les composants du nTOC. Les résultats démontrent le rôle clé des p- et n-TOC dans le contrôle de la biogenèse des chloroplastes sous ABA. Ainsi, mes données donnent un nouvel aperçu de la synchronisation de la biogenèse du chloroplaste dépendante de l'ABA pendant la transition de la graine à la plantule.

ABSTRACT
Chloroplast biogenesis defines the transition of non-photosynthetic proplastids to photosynthetically active chloroplasts in the embryonic cells of germinating seeds (“seed-to-seedling transition”). It is the key to photoautotrophic growth in plants. The chloroplast requires around 2500 nuclear-encoded proteins for its function. These are synthesized in the cytoplasm as preproteins with an N-terminal transit peptide. During chloroplast biogenesis, two classes of preproteins namely photosynthesis-associated and non-photosynthesis-associated ones, are imported by translocons at the outer and inner membrane of the chloroplast, called TOC and TIC, respectively. Two types of TOC complexes exist and accommodate the respective preproteins. They are trimeric and composed of TOC159, TOC33, TOC75 (for photosynthesis- associated proteins, termed pTOC) or TOC132/-120, TOC34, and TOC75 (for non- photosynthesis-associated proteins, termed nTOC). TOC159 and TOC33 (as well as their homologs TOC132/-120 and TOC34) contain GTPase domains and function in preprotein recognition. They assemble with the β-barrel protein TOC75, resulting in a functional trimeric translocon. Notably, the C-terminal domain of TOC159 (as well as TOC132/- 120, predictably) also takes on a β-barrel structure and, together with that of TOC75 forms a hybrid protein translocation channel. Seed germination is promoted by the plant hormone gibberellic acid (GA) and negatively regulated by abscisic acid (ABA). However, there is still a lack of understanding of how these hormones, and especially ABA, impact chloroplast biogenesis and its synchronization with plant development. In this study, I first investigated the global effects of 0.5 μM ABA on the proteome and transcriptome of 36-hour-old seedlings using RNA-seq and mass spectrometry methods. I then analyzed various concentrations of ABA on 72-hour-old seedlings to validate the omics results, with a particular focus on TOC and TIC components and their substrates. mRNA expression and protein accumulation were analyzed by real-time PCR and western blotting, aiming to elucidate the underlying regulatory mechanisms. My transcriptome-wide RNA-seq analysis indicates the downregulation of photosynthesis-related GO terms and the upregulation of non-photosynthesis/stress-related ones in response to ABA treatment. Proteome-wide mass spectrometric analysis revealed that most corresponding proteins exhibited similar behavior. Under ABA also, components of pTOC were downregulated, whereas those of nTOC were upregulated at the protein level. However, RNA levels of both pTOC and nTOC were up. The data indicate that ABA represses chloroplast biogenesis by specific down-regulation of photosynthesis-associated proteins together with pTOC components, whereas nonphotosynthetic/ stress-related proteins are upregulated together with components of nTOC. The results demonstrate a key role for p- and n-TOC in controlling chloroplast biogenesis under ABA. Thereby, my data provide new insight into the ABA-dependent synchronization of chloroplast biogenesis during the seed-to-seedling transition.

Thesis committee:
Prof. Dr. Felix Kessler (Thesis Director) – University of Neuchâtel
Dr. Shanmugabalaji Ventakasalam (Thesis supervisor) – University of Neuchâtel
Prof. Dr. Josephus Vermeer – University of Neuchâtel
Dr. Barbara Pfister – ETH Zurich

4th July 2025

No de thèse : 3207