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Tabacchi, Raffaele

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Tabacchi, Raffaele
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Professeur.e émérite
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https://libra.unine.ch/handle/123456789/32205

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    Synthèse et application de sélecteurs chiraux à base de cyclodextrines en chromatographie gazeuse
    (2006)
    Vaucher, Jean-Marc
    ;
    Tabacchi, Raffaele 
    Ce travail consiste en la synthèse de cyclodextrines dimères substituées par des entités telles que acétyle, t-butyldiméthylsilyle, alkyles, ... en vue de réaliser des colonnes capillaires destinées à l'analyse chirale en chromatographie gazeuse. L'obtention des composés dimériques a nécessité la réalisation de monomères monosubstitués par recours à des voies sélectives. Un soin particulier a été porté à l'optimisation des différentes réactions. La réaction de métathèse, décrite comme inappropriée par certains auteurs a pu être exploitée après étude approfondie du mécanisme réactionnel. Des rendements élevés ont été obtenus. L'usage en chromatographie gazeuse des cyclodextrines dimères synthétisées révèle un pouvoir séparateur au moins comparable à celui des cyclodextrines monomères substituées de façon identique pour un grand nombre d'énantiomères. Dans certains cas, il est observé un accroissement notable du facteur de séparation s'agissant d'énantiomères de taille conséquente. La littérature enseigne que les dimères de cyclodextrines sont d'un apport appréciable s'agissant de la complexation de différentes catégories de substances. Il peut être déduit de ce fait, une certaine potentialité pour cette sorte de cyclodextrine en ce qui concerne la séparation chirale de solutés volumineux., This study comprised the synthesis of cyclodextrin dimers substituted by entities such as acetyl, t-butyldimethylsilyl or alkyls in order to produce capillary columns for chiral analysis in gas chromatography. Production of dimeric compounds required the fabrication of monosubstituted monomers using selective pathways. Particular care was taken of the optimization of the various reactions. The metathesis reaction, considered inappropriate by certain authors, was successfully employed after a thorough study of the reaction mechanism. High yields were obtained. For a large number of enantiomers, the use of synthetic dimeric cyclodextrins in gas chromatography revealed separating powers at least comparable to those of monomeric cyclodextrins with identical substituents. In certain cases a significant increase in the separation factor was observed for bulky enantiomers. According to the literature, dimeric cyclodextrins contribute favourably to the complexation of different categories of substances. It can thus be deduced that this type of cyclodextrin has a certain potential for the chiral separation of bulky solutes.
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    Etude phytochimique et activités biologiques de quatre espèces camerounaises de la famille des Myrtaceae: Eucalyptus saligna Sm., Callistemon viminalis W., Syzygium guineense W. et Syzygium aromaticum M. et P.
    (2005)
    Djoukeng, Jules Désiré
    ;
    Tabacchi, Raffaele 
    Les plantes de la famille des Myrtaceae sont très aromatiques, avec une abondance en huile essentielle d'où l'usage médicinal. Certaines plantes de cette famille sont utilisées traditionnellement dans la conservation des denrées en stockage dans les pays en voies de développement. Afin de mieux comprendre l'utilisation traditionnelle de Eucalyptus saligna Sm., Callistemon viminalis G., Syzygium guineense W. et Syzygium aromaticum Merr. et Perry (Myrtaceae) nous avons entrepris l'étude phytochimique et pharmacologique de ces quatre espèces. Les feuilles et les écorces ont été récoltées dans le département de la Menoua à l'ouest du Cameroun. Elles ont été découpées, séchées, broyées puis extraites au mélange CH2Cl2-MeOH (1:1). Les extraits obtenus ont été testés sur différentes cibles biologiques. Ils ont été ensuite dissous dans l'eau et extrait à nouveau avec l'hexane, l'acétate d'éthyle et au n-butanol et testés. Sur la base de l'activité biologique, les extraits ont été analysés par HPLC-UV, LC-MS et GC-MS et étudiés de façon plus approfondie. Ils ont été fractionnés sur des colonnes ouvertes et par MPLC et HPLC semi-préparative. Une partie de leurs constituants ont été isolés et leurs structures déterminées par des méthodes spectroscopiques, en particulier la RMN (1D, 2D) et la MS. Quarante quatre composés ont été isolés parmi lesquels sept nouveaux produits naturels. Ces molécules sont regroupées en cinq groupes: Les alkylphénols, les dérivés d'acide ellagique, les phloroglucinols, les flavonoïdes et les triterpènes. Les alkylphénols et les triterpènes possèdent des activités antibactériennes, les phloroglucinols ont des activités antibactériennes et antifongiques alors que les flavonoïdes et les dérivés d'acide ellagique possèdent une activité anti-oxidante. Ce travail nous a permis de mieux connaître la phytochimie de ces quatre plantes de la famille des Myrtaceae, d'isoler de nouveaux produits naturels avec des propriétés biologiques et pharmacologiques importantes. Nous avons pu dans certains cas lier l'utilisation traditionnelle des plantes à la présence de certains métabolites secondaires isolés de ces plantes., Plants of the Myrtaceae family are aromatic and rich in essential oils, which explain their use in medicine. Some plants of this family are used traditonnally as post-harvest grain protectants in developing countries. In the aim to understand the traditional uses of Eucalyptus saligna Sm., Callistemon viminalis G., Syzygium guineense W. and Syzygium aromaticum Merr and Perry (Myrtaceae), we studied their phytochemical and pharmalogical properties. The leaves and stem bark of the different plants collected in the Menoua subdivision in west Cameroon were chopped, dried, ground and extracted with the mixture CH2Cl2/MeOH (1:1). The extracts obtained were tested on different microorganisms. After that, they were dissolved in water and successively extracted with hexane, ethyl acetate and n-butanol and tested again. On the basis of these results, the different extracts were analysed by HPLC, LC-MS and GC/MS and studied in-depth. They were fractionated on open column chromatography and then purified by MPLC and semi-preparative HPLC. Some parts of their metabolites were isolated and their structure elucidated by spectroscopic methods in particular NMR (1D and 2D) and mass spectrometry. Forty four compounds were thus isolated among which seven were new natural products. These compounds were grouped into five classes: alkylphenols, ellagic acid derivatives, phloroglucinols, flavonoids and triterpenes. Alkylphenols and phloroglucinols showed antibacterial activity, the latter also showing antifungal activity, whereas ellagic acid derivatives and flavonoids were anti-oxidant. This project allowed us to know better about the phytochemistry of these four plants of the Myrtaceae family and to isolate new natural products with important biological and pharmacological properties. These results enable us in some cases to establish a link between the chemical composition of some plant and their traditional uses in folk medicine.
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    Caractérisation de polyphénols stilbéniques et de dérivés induits ou constitutifs de la vigne impliqués dans sa défense contre l'agent pathogène du mildiou de la vigne, Plasmopara viticola (Berk. and Curt.)
    (2005)
    Jean-Denis, Julien Bernard
    ;
    Tabacchi, Raffaele 
    Le Mildiou de la vigne, causé par un oomycète parasite obligatoire, Plasmopara viticola, est une des maladies les plus redoutées par les viticulteurs. Son apparition est occasionnée par des éclaboussures de pluie et de terre sur les tissues de la vigne après les fortes précipitations véhiculant les zoospores infectieuses présentes à la surface du sol. Certaines variétés comme le Chasselas (V. vinifera) sont sensibles au mildiou et laissent P. viticola germer et se développer. D’autres variétés, dont le Solaris, un cépage interspécifique, montrent des caractères de résistance par la formation de nécroses au niveau de sites d’infection et d’enkystement de zoospores de P. viticola, empêchant le développement du pathogène. Il est maintenant admis que l’accumulation de stilbènes dans les feuilles de vigne est corrélée à la résistance de la vigne contre le pathogène. Les méthodes d’analyse chromatographique couplée à la spectrométrie de masse (LC-ESI-MS et LC-APPI-MS) nous ont permis l’identification de nouvelles substances induites lors de la défense de la vigne contre P. viticola : -la trans-δ-viniférine, le trans-δ-resvépterol et le δ-viniférinol, qui sont aussi des produits obtenus in vitro par oxydation enzymatique d’un mélange de trans¬resvératrol et de trans-pterostilbène. -le trans-ε-resvépterol, 11 formes de resvératrolosides, 3 trimères de resvératrol dont l’α-viniférine, 7 dimères de resvératrol ayant des analogies avec l’ε-viniférine et 4 lignanes. Parmi les composés isolés d’écorce de bois de vigne, l’ampélopsine A, l’hopéaphénol, la vitisine A et les tétramères de resvératrol TT2 et TT2’, seul TT2 étant induit dans la feuille infectée. Néanmoins, l’hopéaphénol, la vitisine A et le mélange de TT2-TT2’ montrent des activités biologiques réduisant la motilité des zoospores de P. viticola. L’acide β-aminobutyrique (BABA) induit l’accumulation de lignanes et de stilbènes dans les feuilles de Chasselas infectées. Une nouvelle stratégie de synthèse du trans-pterostilbène a été élaborée grâce à un double couplage de Heck (rendement total : 11% ). L’origine du pterostibène dans la feuille de vigne infectée est aussi discutée., Downy mildew, caused by an obligatory oomycete, Plasmopara viticola, is a worldwidely distributed grapevine disease. This grapevine disease appears after strong rainy periods which allow zoospores migration from the soil to the plant. Some cultivars as Chasselas (V. vinifera) are sensitive to downy mildew and cannot avoid P. viticola germination and development. Whereas other cultivars as Solaris, an interspecific variety, show resistance capacities with necrosis formation on the infection sites of P. viticola, avoiding the pathogen development. Chromatographic methods coupled to mass spectrometry (LC-APPI-MS and LC-ESI-MS) allowed us to identify new induced substances involved in grapevine plants defense against P. viticola : -trans-δ-viniferin, trans-δ-resvepterol and δ-viniferinol, that we could obtain by in vitro oxidative dimerisation of trans-resveratrol and trans-pterostilbene. -trans-ε-resvepterol, 11 resveratroloside forms, 3 resveratrol trimers among which the α-viniferin has been identified, 7 resveratrol dehydrodimers as ε-viniferin analogues and 4 lignans. Among isolated compounds from grapevine’s bark, ampelopsin A, hopeaphenol, vitisin A and two resveratrol tetramers TT2 and TT2’, only TT2 should be induced in infected grapevine leaves. However, hopeaphenol, vitisin A and a mixture of TT2 and TT2’ show biological activities decreasing the P. viticola zoospores mobility. β-Aminobutyric (BABA) induced the accumulation of lignans and stilbenes in infected Chasselas leaves. A new strategy of trans-pterostilbene synthesis has been investigated through a double Heck reaction (overall yield : 11%). The pterostilbene origin in the infected grapevine leaves is discussed.
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    Synthèse de dérivés d’isocoumarines naturelles, métabolites du champignon pathogène Ceratocystis fimbriata sp.
    (2005)
    Tiouabi, Mustapha
    ;
    Tabacchi, Raffaele 
    Au cours de nos recherches sur les phytotoxines produites par l’espèce Ceratocystis fimbriata, agent pathogène responsable des infections du platane, du caféier et de l’orme, des études analytiques et spectroscopiques ont permis d’isoler et d’identifier les isocoumarines a-f en faible quantité. Notre objectif est de développer une méthode efficace pour une synthèse totale et en quantité suffisante de ces isocoumarines, pour confirmer leurs structures moléculaires et effectuer des études de phytotoxicité et de pathogénecité plus approfondies. Dans ce travail, nous rapportons la synthèse totale des isocoumarines a, b, c, d et e : Deux voies de synthèse sont utilisées pour la préparation des isocoumarines a et b : la première est basée sur une cycloaddition Diels-Alder du diène de Brassard sur un diester allénique, et la deuxième sur une double oxydation de l’orcinol. Une C-acylation suivie d’une énol-lactonisation ont permis d’obtenir ces isocoumarines. La bromation allylique des dérivés acétylés de a et b, suivie d’une substitution nucléophile du brome par l’anion formiate, fourni après hydrolyse acide les iscoumarines c et d. Nous avons aussi développé une nouvelle synthèse de l’orthosporine (e). Sa préparation est effectuée par la condensation du carbanion allylique de l’isocoumarine a, sur l’acétaldéhyde. La synthèse de la dihydroisocoumarine f n’a par contre pas donné le résultat espéré. Nos tentatives d’une synthèse asymétrique selon les models de Sharpless et Zhu, se sont avérées irréalisables. Les essais d’une synthèse racémique ont permis d’obtenir de nouvelles isocoumarines mais pas la molécule f. En conclusion, nos différentes synthèses ont prouvé que l’approche basée sur la cycloadditon des dérivés d’acide homophtalique, est une méthode efficace et généralisable pour la préparation d’autres isocoumarines. Nous avons constaté également que les synthèses établies sur la fonctionnalisation d’une structure stable préalablement existante, sont les plus efficaces. Enfin, les tests biologiques effectués sur les isocoumarines a, b, c et d ont fourni des informations inédites sur la phytotoxicité et les propriétés antifongiques de ces métabolites., During our research on phytotoxins produced by the Ceratocystis fimbriata species, pathogenic agent responsible for the infections of plane, coffee and elm tree, the analytical and spectroscopic studies allowed the isolation and identification of the isocoumarins a-f in small quantity. Our objective is the development of an efficient method for the total synthesis of a sufficient amount of these isocoumarins, in order to confirm their molecular structures and to achieve thorough studies of phytotoxicity and pathogenecity. In this work, we report the total synthesis of isocoumarins a, b, c, d and e : Two synthetic pathways were used for the preparation of isocoumarins a and b : the first is based on the Diels-Alder cycloaddition of Brassard’s diene to allenic diester, and the second on the double oxidation of orcinol. The C-acylation followed by enol-lactonization led to these isocoumarins. The allylic bromination of the acetylated derivatives of a and b, followed by a nucleophilic substitution of bromine by formate anion and acid hydrolysis, afforded iscoumarins c and d. We have also developed a new synthesis of orthosporine (e). The preparation was carried out by condensation of the allylic carbanion of isocoumarin a, on the acetaldehyde. On the other hand, the synthesis of the dihydroisocoumarin f did not give the expected result. Our attempts of an asymmetric synthesis according to Sharpless and Zhu models were not realizable. The assays of a racemic synthesis led to a new isocoumarins but not to f. In conclusion, our different syntheses proved that the approach based on the cycloadditon of homophtalic acid derivatives, is an efficient method and can be generalized for preparation of others isocoumarins. We have also observed that the syntheses established on the fonctionalization of an existing stable structure, are the most efficient. Finally, the biological assays of isocoumarins a, b, c and d provided new informations about the phytotoxicity and antifungal properties of these metabolites.
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    Isolation and identification of secondary metabolites from the fungus Phomopsis spp., a pathogen responsible for vine excoriosis
    (2005)
    Mottier, Nicolas
    ;
    Tabacchi, Raffaele 
    Grapevine diseases are of great importance as they affect production and harvesting causing serious yield loss. The amount of damage or loss is often dependant on the climate of the region and the cultural practices of the grape growers. Control of these diseases is generally done using fungicide sprays and management techniques such as leaf plucking, pruning, etc. Epidemics do occur from time to time when even the most rigorous management cannot control the disease because of favourable weather conditions. One usually differentiates trunk and root diseases, e.g. Eutypa dieback and esca, from fruit and foliar diseases such as downy mildew, powdery mildew and grey rot. Grapevine trunk diseases are responsible for significant economic losses to the wine industry worldwide. Symptoms of these diseases include dead spurs, arms and shoots and eventual vine death due to canker formation in the vascular tissue. In Eutypa dieback, deformed leaves and shoots occur as the pathogen invades the ramifications. As cankers develop, yield reductions occur due to the loss of productive wood. The impact of grapevine wood diseases usually becomes more severe as vineyards get older until they weaken and eventually kill vines. Foliage and developing bunches must also be protected from attack by various pests, especially fungal pathogens, for the production of satisfactory yields of good-quality grapes, and especially for adequate vinification. To maintain economic production it is essential to use specific fungicides and correct application of plant protection products. However, the chemicals used can be non specific or used on a large scale at the wrong time either in the absence of the inoculum of the pathogen or under conditions that are not favourable for the disease development. Thus, the inappropriate use of these products with the increased realisation of environmental issues has lead to the need for growers and managers to adopt responsible and intelligent disease management systems. Understanding of grapevine diseases and their causal agents is vital as it can bring precious information for alternative pathways in management of the pathogens. Since 1986, grapevine diseases have been one of the main fields of research of the group of Professor R. Tabacchi with works published on esca, eutypa dieback, gray rot and downy mildew. The following project is the continuation of this research with the study of a worldwide spread disease, excoriosis or Phomopsis cane and leaf spot. This disease is caused by a fungus called Phomopsis viticola which can cause serious damage when weather conditions are suitable. The main symptoms are necrotic lesions on canes and shoots, black spots on leaves and, rarely, fruits. In collaboration with the group of Professor G. Défago of the Swiss Federal Institute of Technology, twelve strains of the fungus were collected from a grapevine field in Ticino, Switzerland. After growing the fungi on an artificial media, chemical metabolites were profiled using high-performance liquid chromatography and biological assays against grapevine leaf disks were performed. We decided to upscale the culture and study further three of the strains. Using the modern current separation and identification techniques, such as HPLC-UV and 1D and 2D NMR, we isolated several secondary metabolites produced by the fungus. Furthermore, the fungus was grown on grapevine wood pruned after harvest in order to have culture conditions as close to reality as possible. As detection of the metabolites in the wood must allow for low detection limits, LC-(API)-MS was the method of choice for this research.
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    Host-Plant Use in the Specialist Leaf Beetle Oreina gloriosa : the Role of Linear Furanocoumarins
    (2004)
    Nessi, Luca
    ;
    Rahier, Martine 
    ;
    Tabacchi, Raffaele 
    ;
    Küpfer, Philippe 
    ;
    Städler, Erich
    La chrysomèle alpine Oreina gloriosa (Coleoptera: Chrysomelidae) est hautement spécialisée sur l'ombellifère Peucedanum ostruthium (Apiaceae), l'impératoire. Dans la nature, adultes et larves sont très sélectifs: les uns et les autres se nourrissent exclusivement de feuilles, mais surtout, ils choisissent certaines plantes et en ignorent complètement d'autres. En outre, des études préliminaires ont suggéré que les larves soient actives la nuit. Comme de nombreuses autres apiacées, P. ostruthium synthétise plusieurs furanocoumarines linéaires, métabolites secondaires décrits pour leur activité antiappétante et/ou toxique à l'égard d'insectes phytophages généralistes. Par ailleurs, les furanocoumarines linéaires sont connues pour leur action phototoxique: le rayonnement ultraviolet proche du spectre visible induit chez ces substances une excitation électronique qui peut déterminer différents processus toxiques au niveau cellulaire. Le but de cette étude a été de vérifier l'hypothèse selon laquelle la chimie secondaire de P. ostruthium constituerait un facteur explicatif de l'utilisation de la plante hôte par la strictement monophage O. gloriosa. Toute la recherche a été menée au sein d'une seule population de la plante et de la population du coléoptère qui lui est inféodée.

    Dans un premier temps, nous avons étudié le rythme d'activité de la chrysomèle sur les 24 heures dans son mileu. Ce travail a révélé que les larves se nourrissent exclusivement pendant la nuit et s'enfoncent dans le sol pendant le reste de la journée. Certaines jeunes larves se retirent dans les gaines ou les bourgeons. Au contraire, les adultes ont été observés sur les plantes pendant les 24 heures. Nous avons ensuite vérifié si la croissance larvaire était affectée par la photoactivation des furanocoumarines. Pour cela, les larves ont été placées dans deux environnements lumineux, avec et sans rayonnement ultraviolet. La mortalité a été plus grande dans le deuxième traitement: nous n'avons néanmoins pas pu tirer de conclusions définitives sur l'effet de la photoactivation des furanocoumarines. Dans un travail de terrain, nous avons montré que les invertébrés antagonistes de O. gloriosa sont essentiellement actifs pendant la nuit. Au vu du chevauchement entre les périodes d'activité de la chrysomèle et de ses prédateurs, nous suggérons que les ennemis naturels ne constituent pas la raison d'être du comportement des larves. Nous proposons que l'activité nocturne représente une contre-adaptation à la photoactivité des furanocoumarines. Il s'agirait alors d'un rare exemple d'adaptation comportementale chez un insecte spécialisé sur une plante hôte avec furanocoumarines linéaires. En effet, les insectes avec un régime alimentaire strictement lié à ces métabolites secondaires, disposent en général de moyens de détoxification métaboliques. La différence comportementale entre larves et adultes est probablement liée à l'épaisseur et à la pigmentation de la cuticule imaginale, vraisemblablement opaque à la lumière ultraviolette.

    Nous avons également vérifié l'hypothèse selon laquelle O. gloriosa dans la nature sélectionnerait les plantes en fonction de leur attributs chimiques. Nous avons échantillonné des plantes fortement consommées et des plantes libres de toute attaque d'O. gloriosa. Les feuilles ainsi récoltées ont été extraites et analysées par chromatographie liquide pour déterminer la composition qualitative et quantitative en furanocoumarines linéaires. La chimie secondaire a permis de bien discriminer plantes consommées et non consommées. O. gloriosa est probablement à même de reconnaître certaines de ces substances comme signaux ou elle est en mesure de mieux en tolérer certaines plutôt que d'autres dans leur action toxique. De toute façon, la chimie secondaire explique, du moins en partie, l'utilisation de la plante hôte par ce coléoptère strictement monophage au sein d'une population de sa plante nourricière. Cet exemple révèle la nécessité d'approfondir l'investigation, trop souvent négligée, du rôle de la variation chimique intrapopulationnelle dans les études concernant la convenance de l'hôte pour des insectes spécialistes., The alpine leaf beetle Oreina gloriosa (Coleoptera: Chrysomelidae) is highly specialized on the umbelliferous plant Peucedanum ostruthium (Apiaceae). Adults and larvae feed on leaves and clearly discriminate between individual plants in nature. Preliminary studies suggested that the larvae are active at night. Like many other apiaceous plants, P. ostruthium produces several linear furanocoumarins, secondary metabolites shown to be deterrent and/or toxic to generalist herbivorous insects. Moreover, linear furanocoumarins are well known as phototoxins: when irradiated with long-wave ultraviolet light, these compounds enter an excited state which can mediate different within cell toxic processes. The aim of the present thesis was to verify the hypothesis that the secondary chemistry of P. ostruthium is a factor explaining the actual host-plant use by the strictly monophagous O. gloriosa. All of our work concentrated on a single plant population and its affiliated beetle population.

    We firstly investigated the daily activity rhythm of the beetles in the field. Larvae have been shown to feed exclusively at night and to burrow into the soil for the remainder of the day. Some young larvae hid within sheaths or buds during daylight. In contrast, adults were found on the plants over the 24 hours. We further verified if the performance of the larvae was affected by the photoactivation of the linear furanocoumarins. Larvae were forced to remain in two different light environments, with and without ultraviolet radiation. O. gloriosa was shown to suffer higher mortality when forced under light with ultraviolet radiation. Nonetheless, we were not able to draw definitive conclusions on the effect of the furanocoumarin photoactivation. In a field study, we showed that invertebrate natural enemies of O. gloriosa are mainly active at night. Because of the congruence in time between the beetle and the predators activities we suggest that natural enemies should not be considered as a driving force for the larval night behaviour. We propose that night activity counteracts the photoactive furanocoumarins and should be considered a rare example of behavioural adaptation in a linear furanocoumarin-specialized insect. In fact, specialists are reported to rely on metabolic detoxification. The difference in the behaviour between larvae and adults may be related to the thick and pigmented cuticle of the latter, probably opaque to ultraviolet light.

    Finally we tested the hypothesis that individual plants remain free from O. gloriosa attack due to their chemical attributes. Samples of plants hosting actively feeding O. gloriosa (strongly consumed leaves) and plants exhibiting no damage (unattacked leaves) were collected in the field and examined by HPLC for their qualitative and quantitative linear furanocoumarin composition. The secondary chemistry allowed us to clearly segregate attacked and unattacked plants. We suggest that plant chemistry, relative to the ability of O. gloriosa to tolerate or recognise plant chemicals, can to some extent explain the host use of this monophagous leaf beetle within a population of its host plant. This shows the need for further work on the neglected impact, for specialists, of intrapopulation variation in secondary chemistry on host suitability., Il crisomelide alpino Oreina gloriosa (Coleoptera: Chrysomelidae) è altamente specializzato sull'ombellifera Peucedanum ostruthium (Apiaceae), l'imperatoria vera o erba rena. Adulti e larve in natura sono estremamente selettivi: gli uni e le altre si nutrono solo di foglie, ma distinguono tra le singole piante cibandosi di alcune e trascurandone completamente altre. Inoltre indagini preliminari hanno suggerito che le larve siano attive di notte. Analogamente ad altre ombellifere, P. ostruthium contiene varie furanocumarine lineari, metaboliti secondari con effetto deterrente e/o tossico per insetti fitofagi generalisti. Le furanocumarine lineari sono pure note per la loro fototossicità: la luce ultravioletta di lunghezza d'onda vicina allo spettro visibile induce in queste sostanze un'eccitazione elettronica che può provocare vari processi tossici a livello cellulare. La nostra tesi aveva lo scopo di verificare l'ipotesi secondo cui la chimica secondaria di P. ostruthium spiegherebbe l'utilizzazione della pianta ospite - così come l'osserviamo oggi - da parte dello specialista O. gloriosa. Per l'insieme della ricerca ci siamo concentrati su una singola popolazione della pianta e sulla popolazione dell'insetto ad essa legata.

    Per prima cosa abbiamo studiato il ritmo di attività dei coleotteri in natura. Abbiamo mostrato che le larve si nutrono esclusivamente di notte e passano il resto della giornata nel suolo. Alcune giovani larve si ritirano dentro le guaine o i germogli. Gli adulti invece sono presenti sulle piante durante tutte le 24 ore. In una ricerca successiva abbiamo verificato se la crescita larvale sia compromessa dalla fotoattivazione delle furanocumarine lineari. Abbiamo tenuto le larve in due distinti ambienti luminosi, con e senza radiazione ultravioletta. Quest'ultima ha determinato una maggiore mortalità di O. gloriosa, tuttavia non siamo stati in grado di formulare conclusioni definitive sull'effetto della fotoattivazione. Un lavoro sul campo ha mostrato che gli invertebrati antagonisti del crisomelide sono essenzialmente attivi di notte. Dato che i periodi di attività di O. gloriosa e dei suoi predatori si sovrappongono, suggeriamo che i nemici naturali non costituiscano il fattore selettivo all'origine del comportamento notturno delle larve. Proponiamo che questa limitazione notturna nell'attività trofica rappresenti un'acquisizione adattativa contro la fotoattività delle furanocumarine. Si tratterebbe allora di un raro esempio di adattamento comportamentale in un insetto specializzato su una pianta contenente furanocumarine lineari. In effetti, in generale gli insetti con un regime alimentare strettamente legato a queste sostanze dispongono di strumenti di detossificazione metabolici. La differenza comportamentale tra larve e adulti potrebbe essere ricondotta al tegumento spesso, colorato e probabilmente opaco alla luce ultravioletta di questi ultimi.

    Abbiamo infine verificato l'ipotesi secondo cui la chimica secondaria determinerebbe l'idoneità delle singole piante per la crescita di O. gloriosa. Abbiamo proceduto ad un campionamento sul campo di piante fortemente consumate e di piante prive di qualsiasi segno d'attacco del crisomelide. Le foglie così raccolte sono state estratte e analizzate con la cromatografia liquida per determinare la composizione qualitativa e quantitativa delle furanocumarine. La chimica secondaria ha permesso di ben caratterizzare le piante consumate rispetto a quelle non utilizzate. O. gloriosa è probabilmente in grado di riconoscere talune di queste sostanze quali segnali o di tollerarne alcune piuttosto di altre nella loro azione di tossine. In ogni caso, la chimica secondaria permette di spiegare perlomeno in parte l'utilizzazione della pianta in seno ad una popolazione da parte di questo coleottero altamente specializzato. Questo risultato rivela l'interesse di ulteriori ricerche su un aspetto spesso ignorato quale è l'impatto, per artropodi specialisti, della variazione intrapopolazionale nella chimica secondaria sull'idoneità della pianta ospite.
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    Analytical development and traceability in food chemistry: examples of application to Swiss and foreign Emmental cheese
    (2004)
    Pillonel, Laurent
    ;
    Tabacchi, Raffaele 
    La présente thèse de doctorat est divisée en quatre parties principales. Dans la première partie, la problématique de la préconcentration des composés volatils est traitée de manière à étendre le champ d'application des nez électroniques (ENs). Un article de revue fait ressortir les avantages des techniques à équipement portatif telles que la micro-extraction en phase solide (SPME) et l'extraction dynamique en phase solide (SPDE). Toutes deux ont montré une efficacité comparable avec l'équipement SMart Nose, bien que la SPDE soit moins sujette au vieillissement. Divers fromages fondus, conditionnés en capsules d'aluminium et congelés, ont été testés durant plusieurs années comme matériaux de contrôle pour la chromatographie en phase gazeuse (stabilité à long terme de composés volatils dans une matrice de type fromage). Ces fromages fondus ont ensuite été utilisés pour illustrer la transférabilité de données entre deux ENs de même type, condition nécessaire pour construire des bases de données pour la pratique quotidienne. Dans la deuxième partie du travail, un criblage d'un grand nombre de méthodes analytiques a été effectué afin d'évaluer leur potentiel pour l'authentification de l'origine géographique de l' Emmental. Vingt échantillons de fromages provenant de six régions européennes ont été soumis à des analyses chimiques, biochimiques, microbiologiques, physiques et sensorielles. Les paramètres les plus prometteurs retenus pour la suite du projet étaient les acides volatils à courte chaîne, le chlorure, la valeur de pH, l'azote total, l'azote soluble dans le TCA à 12%, l'azote soluble dans l'eau, le cuivre, le sodium, le magnésium, le zinc, les entérocoques, les Lactobacilles hétérofermentatifs obligatoires, Lb helveticus, le lactate L et D, le succinate, le pyruvate, la L-leucine-aminopeptidase ainsi que les rapports isotopiques d2H, d13C, d15N et d34S. Dans la troisième partie, les paramètres sélectionnés ont été mesurés dans 110 échantillons de fromage Emmental d'hiver et 73 d'été collectés dans sept régions, à savoir la Suisse, la France/Savoie, la France/Bretagne, la France/Est-central, le sud de l'Allemagne, l'Autriche et la Finlande. Les données analytiques ont été traitées par analyse statistique multivariée de manière à classer les échantillons selon leur origine géographique. L'analyse discriminante (DA) et les réseaux artificiels de neurones ont donné des résultats comparables. La DA permet une réduction du nombres de facteurs grâce à une "stepwise backward elimination". Dans un modèle incluant seulement onze facteurs, une classification correcte à 95% selon les sept régions d'origine a été obtenue avec une validation croisée de type "Jackknife". Cinq échantillons suisses sur 70 ont été mal classés. Pour améliorer ce score, un modèle avec une approche par paires (Suisse vs une seule région étrangère à la fois) a été proposé. Ce dernier a permis d'identifier tous les échantillons suisses en utilisant quinze paramètres. Dans la quatrième et dernière partie, un criblage ciblé a été appliqué à deux autres sortes de fromage, la Raclette et la Fontina. La Raclette Suisse® et la raclette française ont facilement pu être discriminées grâce au contenu en calcium et aux quatre rapports d'isotopes stables d2H, d13C, d15N et d34S. La Fontina AOC est un fromage au lait cru. Par conséquent sa teneur en phosphatase alcaline était nettement plus élevée que celle des fromages de type Fontal qui sont des imitations industrielles fabriquées avec du lait pasteurisé. Le dernier chapitre propose aux chimistes cantonaux des directives pour authentifier l'Emmentaler Switzerland™. On y discute également des risques potentiels auxquels sont exposées les principales sortes de fromages suisses quant à une éventuelle tromperie sur la déclaration d'origine. , The current Ph.D. work is divided into four main parts. In the first one, the problematic of volatile compound preconcentration is dealt with to extend the application range of electronic noses (ENs). A review article highlights the advantages of portable equipments such as Solid Phase Micro-Extraction (SPME) and Solid Phase Dynamic Extraction (SPDE). Both showed comparable efficiencies when applied to the SMart Nose equipment, though the second one was less subject to ageing effects. Various canned processed cheese types stored deep frozen were tested for several years as control materials for gas chromatography (long term stability of volatile compounds in cheese-like matrices). These processed cheeses were then used to illustrate the data transferability between two ENs of same type, condition necessary to build usable databases for the daily practice.In the second part of the work, a screening of a great number of analytical methods was carried out to evaluate their potential for the authentication of the geographic origin of Emmental cheese. Twenty Emmental samples from six European regions were investigated on chemical, biochemical, microbiological, physical and sensory parameters. The most promising ones retained for the follow-up of the project were, volatile short-chain acids, chloride, pH-value, total nitrogen, 12%-TCA soluble nitrogen, water soluble nitrogen, copper, sodium, magnesium, zinc, enterococci, obligate heterofermentative Lactobacilli, Lb helveticus, L/D-lactate, succinate, pyruvate, L-leucine-aminopeptidase, d2H, d13C, d15N and d34S isotope ratios. In the third part, the selected parameters were measured in 110 winter and 73 summer Emmental cheese samples collected in seven European regions, i.e. Switzerland, France Savoie, France Bretagne, France East-Central, South Germany, Austria and Finland. The analytical data was then processed using multivariate statistical analysis leading to pattern recognition and classification according to the geographic origin of the cheeses. Discriminant analysis (DA) and artificial neural networks delivered similar results. DA made it possible a reduction of the number of factors thanks to stepwise backward elimination. In a model including only eleven factors, 95% correct classification in the seven regions was achieved in the Jackknifed validation. Five Swiss Emmental samples out of 70 were misclassified. To improve the classification of the latters, a model with a pairwise approach (Switzerland vs a single foreign region at a time) was proposed. This procedure made it possible to recognise all Swiss samples correctly using fifteen parameters.In the fourth and last part, a targeted screening was applied to two other cheese types, i.e. Raclette and Fontina cheeses. Raclette Suisse® and French Raclette cheese could be easily discriminated using the calcium content and the four stable isotope ratios d2H, d13C, d15N and d34S. Fontina PDO is a raw milk cheese. Consequently its alkaline phosphatase content was much higher than in the Fontal cheeses, which are industrial imitations manufactured with pasteurised milk. The last chapter is a guide line dedicated to the Swiss canton chemists for authenticating the Emmentaler Switzerland™. It discusses also the risks encountered by the most important Swiss cheese types toward mislabelling of origin.
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    Synthèse de polyéthers linéaires cycliques substitués par des cyclodextrines: application en chromatographie gazeuse et électrophorèse capillaire
    (2002)
    Tharin, Manuel
    ;
    Tabacchi, Raffaele 
    La détermination univoque des compositions énantiomériques et des configurations absolues se révèle être une tâche d'importance primordiale. En effet, dans de très nombreux cas, les interactions spécifiques entre les récepteurs des systèmes vivants et les substrats considérés sont intimement liées à la chiralité de ceux-ci. Actuellement, la quasi-totalité des sélecteurs chromatographiques chiraux développés sont constitués d'une unique entité cyclodextrine dont la substitution varie selon les besoins. Nous nous sommes proposés de réaliser des composés macromoléculaires incorporant plusieurs unités oligosaccharides, reliées de façon covalente par un pont polyéther (linéaire ou cyclique). Ceci afin d'évaluer, par comparaison avec les cyclodextrines monomères analogues, l'effet coopératif des cyclodextrines d'une même entité moléculaire d'une part, et/ou d'une cyclodextrine et du pont polyéther associé d'autre part. Ce travail décrit la synthèse et la caractérisation (RMN, MS, DSC) d'une série de nouveaux sélecteurs chiraux ainsi que l'évaluation de leurs sélectivités lorsque employés en chromatographie gazeuse et en électrophorèse capillaire. La variation de la nature du pont ainsi que des substituants sur les cyclodextrines permet de moduler les propriétés physiques (polarité, viscosité, point de fusion,…) et chromatographiques des composés cibles. La comparaison des valeurs de a pour les nouveaux sélecteurs et les cyclodextrines peralkylées analogues révèle des différences plus ou moins marquées de sélectivité, particulièrement entre colonnes pourvues ou non d'éthers couronne. Ceci étant l'indice d'une interférence du polyéther central dans le mécanisme de reconnaissance, The univocal determination of enantiomeric compositions and absolute configurations proves to be a task of paramount importance. Indeed, in very many cases, the specific interactions between the receptors of living systems and the substrates considered are closely related to their chirality. Currently, nearly all developed chiral chromatographic selectors consist of a single cyclodextrin entity whose substitution varies according to needs. We synthetized macromolecular compounds incorporating several oligosaccharide units, connected in a covalent way by a polyether bridge (linear or cyclic). This was done in order to evaluate, by comparison with the similar monomeric cyclodextrins, the cooperative effect of several cyclodextrins of the same molecular entity on one hand, and/or of a cyclodextrin and the associated polyether bridge on the other hand. This work describes the synthesis and characterization (NMR, MS, DSC) of a series of new chiral selectors as well as the evaluation of their selectivities when used in gas chromatography and capillary electrophoresis. The variation of the nature of the bridge as well as the substituents on the cyclodextrins makes it possible to modulate the physical (polarity, viscosity, melting point,…) and chromatographic properties of the target compounds. The comparison of the values of a for the new selectors and the similar peralkylated cyclodextrins reveals more or less marked differences in selectivity, particularly between columns equipped or not with crown ethers. This being an indication of interference of the central polyether in the mechanism of recognition
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    Synthèse asymétrique de naphtalènones naturelles d'origine fongique
    (2001)
    Couché, Emmanuel
    ;
    Tabacchi, Raffaele 
    Au cours de nos investigations sur la recherche de métabolites phytotoxiques responsables des maladies du platane, du caféier, de la vigne ou de l'orme, différentes 3,4-dihydro naphtalèn-1(2H)-ones polyhydroxylées, issues de la biosynthèse de la DHN-mélanine fongique, ont été isolées. Certaines de ces substances, telle que la 3,4-dihydro-2,4,8-trihydroxynaphtalèn-1(2H)-one, développent de profondes nécroses sur les cellules végétales. En revanche, la 3,4-dihydro-3,4,8-trihydroxynaphtalèn-1(2H)-one ne semble pas présenter de toxicité sur la plante. La grande disparité des résultats existants dans la littérature sur la toxicité potentielle des naphtalènones nous ont incité à développer une voie de synthèse générale dans l'élaboration de ces composés pour pouvoir, par la suite, affiner l'étude de leur biotoxicité. Nous rapportons dans ce manuscrit, la synthèse asymétrique des cis et trans 3,4-dihydro-2,4,8-trihydroxynaphtalèn-1(2H)-one 1-2 et la synthèse stéréosélective des cis et trans 3,4-dihydro-3,4,8-trihydroxynaphtalèn-1-(2H)-one 3-4. L'utilisation d'ouvertures de 4 ou 7-alkyloxyphtalides par réaction tandem de Michaël-Dieckmann en présence de différents accepteurs de Michaël a permis d'accéder aux naphtalènones intermédiaires respectives A et B. A partir de cette étape clef, une étude comparative sur les techniques d'introduction de l'hydroxyle en a du carbonyle a été réalisée. Soit, en effectuant l'introduction directe de l'hydroxyle à l'aide d'une N?sulfonyloxaziridine en série racémique ou en série optiquement active sur l'énolate métallique de l'intermédiaire, soit après décarboxylation de cet intermédiaire, par différentes méthodes oxydantes de l'éther d'énol silylé. Dans cette seconde voie, l'emploi d'une dihydroxylation asymétrique de Sharpless sur l'éther d'énol silylé a permis d'accéder aux composés finaux optiquement actifs. La détermination de la configuration absolue des carbones a été obtenue pour les cis et trans 3,4-dihydro-2,4,8-trihydroxynaphtalèn-1(2H)-ones. La mesure des spectres de dichroïsme circulaire a permis de déterminer, par comparaison, les énantiomères naturels produits par Ceratocystis fimbriata sp. platani. Enfin, le contrôle de la stéréoselectivité lors de la synthèse en 8 étapes à partir de la juglone des cis et trans 3,4-dihydro-3,4,8-trihydroxy naphtalèn-1(2H)-one a pu être engendré par ouverture ou non d'un pont di-tert-butyl silylène., In our investigations on the phytotoxic substances involved in the diseases of plane tree, coffea, grapevine or ducth elm tree, several polyhydroxylated 3,4-dihydro naphthalen-1(2H)-ones that come from the biosynthesis of the fungal DHN-melanin have been isolated. Some of the substances, such as the 3,4-dihydro-2,4,8-trihydroxynaphthalen-1(2H)-one, developed deep necrosis on the plant cells. In contrast the 3,4-dihydro-3,4,8-trihydroxynaphthalen-1(2H)-one does not seem present toxicity towards the plant. The large disparity of results which exist in the literature on the potential toxicity of naphthalenones incited us to develop a general synthetic pathway in the work out of these compounds in the aim to confirm their biotoxicity. Here we report the asymmetric synthesis of cis and trans 3,4-dihydro-2,4,8-trihydroxy naphthalen-1(2H)-one 1-2 and the stereoselective synthesis of cis and trans 3,4-dihydro-3,4,8-trihydroxy naphthalen-1-(2H)-one 3-4. The ring opening of 4 or 7-alkyloxyphthalides by tandem reaction of Michaël-Dieckmann in the presence of different Michaël acceptors, allowed us to attain to the intermediates naphthalenones A and B. From this key step, a comparative study on the methods of introduction of a hydroxyle group on the a position of carbonyl was realised. It was either carried out by the direct introduction of the hydroxyle group with a N?sulfonyloxaziridine in a racemic pathway or an asymmetric pathway on metallic enolate of this intermediate, either after decarboxylation of this intermediate by different oxidative protocol of silyl enol ether. With the second pathway, by using an asymmetric dihydroxylation of Sharpless on the silyl enol ether we can get the final compounds optically active. The determination of the absolute configuration was obtained for the cis and trans 3,4-dihydro-2,4,8-trihydroxynaphthalen-1(2H)-ones. The measure of circular dichroism has permitted to determine by comparison the naturals enantiomers produced by Ceratocystis fimbriata sp. platani.
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    Analyse de tannins inhibiteurs de la stilbène oxydase produite par Botrytis cinerea Pers.: Fr
    (2001)
    Perret, Camille
    ;
    Tabacchi, Raffaele 
    Botrytis cinerea est le champignon pathogène responsable de la pourriture grise. Cette maladie est économiquement importante, car elle détruit chaque année une partie des récoltes viticoles et horticoles (fraises, concombres, tomates…). Ce champignon infecte les baies de raisin à la floraison, mais reste latent durant toute la période estivale pour reprendre son développement à la véraison, provoquant le pourrissement de la grappe. Certaines variétés, comme le Gamaret, sont résistantes à l'attaque par Botrytis cinerea et d'autres, comme le Gamay, y sont très sensibles. Ce phénomène de latence serait entre autre attribué à la production de phytoalexines par la vigne (resvératrol (1), pterostilbène (2) et e-viniférine (3)) inhibant le développement du champignon de juin à septembre. Le resvératrol et le pterostilbène font partie de la famille des stilbènes et sont des composés synthétisés par la plante suite à un stress. Ces molécules peuvent s'oxyder sous l'action d'enzymes, la stilbène oxydase et les peroxydases, pour former respectivement le resvératrol trans-déhydrodimère (4), le pterostilbène déhydrodimère (5) et l'e-viniférine. Le resvératrol est faiblement toxique envers Botrytis cinerea, ce qui n'est pas le cas pour le pterostilbène, qui est le composé le plus actif synthétisé par la plante. L'e-viniférine et le resvératrol trans-déhydrodimère montrent une toxicité modérée contre le champignon. Quant au pterostilbène déhydrodimère, il est totalement inactif envers Botrytis cinerea. Lors d'un stress abiotique (par exemple l'attaque par un agent pathogène), la concentration de resvératrol augmente, alors que le pterostilbène tend à disparaître complètement. La stilbène oxydase est une enzyme produite par Botrytis cinerea qui est donc capable d'oxyder les stilbènes. Cette enzyme est inhibée par les tanins présents dans la plante. Ce travail met en évidence l'inhibition de l'enzyme par les tanins extraits de Gamay et de Gamaret en fonction de leur poids moléculaire et de la maturité du raisin. Les tanins de la grappe sont composés d'un mélange de proanthocyanidines et de proanthocyanidines galloylées. Ces molécules sont reliées entre-elles par une liaison carbone-carbone, formant un polymère de taille variable (entre 2 et 50 unités monomériques). Ces composés sont très polaires dû à un grand nombre de groupements hydroxyles, et de se fait, sont difficile à séparer et à analyser. La spectrométrie de masse s'est avérée être la méthode de choix pour la caractérisation de ces polymères. La deuxième partie de ce travail décrit le développement de méthodes d'analyse des tanins par différentes techniques en spectrométrie de masse. Malgré l'utilisation d'ionisations douces, telle que l'électrospray, il n'a pas été possible de détecter des ions au-delà de 3000 uma. L'utilisation de différents types d'analyseurs (Ion Trap et FT-ICR/MS) ne n'a pas permis de contrer ce problème. De ce fait, nous avons utilisé la technique d'ionisation MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) couplé a un analyseur TOF (Time-Of-Flight). Les résultats obtenus permettent de détecter des ions au-delà de 4000 uma, Grey mould is one of the most important diseases of grapes. Flowering clusters are infected by the fungus Botrytis cinerea, but it does not develop until ripening. This latency is probably maintained by an unfavourable environment, corresponding to the production of phytoalexins (resveratrol (1), pterostilbene (2) and e-viniferin (3)). Some varieties, as Gamaret, are very resistant to the fungus and some, as Gamay, are very sensitive. These stilbenic compounds are present in vine at low concentration. Enzymes, such as stilbene oxidase and peroxidases, are able to oxidize these molecules to form, respectively, resveratrol trans-dehydrodimer (4), pterostilbene dehydrodimer (5) and e-viniferin. As described in the literature, resveratrol is not toxic against Botrytis cinerea, compared to pterostilbene, which is the most toxic compound produced by the plant. e-viniferin and resveratrol trans-dehydrodimer show higher activity than resveratrol. Pterostilbene dehydrodimer is not active against the fungus. Under stress (for example, when the plant is attacked by a pathogen agent), the concentration of resveratrol increases and the pterostilbene tends to disappear. Stilbene oxidase is an enzyme produced by Botrytis cinerea, which might oxidize stilbenic compounds. The tannins present in the grape inhibit this enzyme. This work describes the enzyme inhibition by tannins extracted from Gamay and Gamaret varieties according to their molecular weights and grape maturity. Grape tannins are composed of proanthocyanidins and galloylated proanthocyanidins. These molecules are linked by a carbon-carbon bond, generating a polymer of various size (between 2 or 50 monomeric units). These compounds are very polar and thereby difficult to separate and analyse. Mass spectrometry is a suitable method for the analysis of such polymers. The second part of this work describes the development of new analytical methods for the characterization of tannins by mass spectrometry. Soft ionization as electrospray, did not allow the detection of ions up to 3000 uma. The use of different analysers such as Ion Trap and FT-ICR/MS did not help us for solving this problem. For that reason, we tried the MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) ionization technique coupled to a Time-Of-Flight analyser, which permits the detection of higher masses up to 4000 uma