Artificial metalloprotein based on biotin-(strept)avidin technology: thermodynamic, kinetic and selectivity considerations

Catalyses homogènes et enzymatiques se situent dans un premier rang pour la création des catalyseurs efficaces plus souvent utilisés dans l’hydrogénation énantioselective (industrie et académique). Nos efforts étaient axés sur la création de metalloenzymes artificielles basées sur la technologie biotine-(strept)avidine. L’ancrage d’un complexe-aminodiphosphine biotinylé dans la (strept)avidine permet de créer un catalyseur « hybride » efficace possédant les avantages de catalyseur homogène et enzyme. Introduction d’éspaceur chiral dans le composé biotinylé (nouvelle génération de métalloenzymes artificielles) montre quelques résultats intéressants. Le catalyseur le plus efficace était la combinaison de [Rh(COD)Biot-(R)-Pro-1]+ ⊂ S112W Sav (95% (S)) pour la réduction de N-α-acetamidoacrylique acide et N-α-cetamidocinammique acide. Ainsi la nouvelle génération de métalloenzymes artificielles montre la résistance en présence de la quantité importante du solvant organique. De plus, il est possible d’immobiliser les métalloenzymes artificielles sur le support biotine-sepharose grâce aux 4 sites actifs de la (strept)avidine. Une étude cinétique réalisée montre que la présence de la protéine peut accélérer la vitesse de la réaction (jusqu’à 3 fois par rapport au catalyseur sans protéine). Enfin, une étude thermodynamique exploitant l’incorporation de composé biotinylé [Ru(bpy)2(Biotbpy)] 2+ dans la (strept)avidine a été réalisée pour le but de déterminer les constantes d’affinité de composé biotinylé dans la protéine (5-7 ordres de magnitude plus faible par rapport à la biotine)., The present work describes our efforts in the design of artificial metalloenzymes based on biotin-(strept)avidin technology. The metal biotinylatedprecursor ensures the activity of the catalyst, whereas the host protein governs the enantioselectivity of artificial metalloenzymes. This study focused on the introduction of chiral spacer between metal precursor and biotin anchor (second generation of artificial hydrogenases), as well as chemo-genetic strategy for screening. The best result of the second-generation artificial hydrogenases is combination of [Rh(COD)Biot-(R)-Pro-1]+ ⊂ S112W Sav (95% (S)) for the reduction of N-α-acetamidoacrylic acid et N-α-acetamidocinammic acid. The second-generation artificial hydrogenases displayed high selectivity in the presence of high concentration of organic solvent. In addition, as (strept)avidin possesses 4 binding sites, it was demonstrated that it is possible to immobilize one binding site leaving 3 free sites for the incorporation of the biotinylated precursor. The immobilization was achieved using commercially available biotin-sepharose. Kinetic study shows an increase of reaction rate (up to three fold) using artificial metalloenzymes compared to the free-protein catalyst. Moreover, the incorporation of biotinylated coordination compounds [Ru(bpy)2(Biot-bpy)]2+ in (strept)avidin displays a significant decrease of binding affinity (5-7 orders of magnitude) than biotin.

Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel, 2007 ; Th.1965