A multidisciplinary approach to describe the calcareous alpine plant recent diversification: A case study of the "Primula auricula" complex

Les Alpes constituent actuellement l'habitat principal des plantes orophytes (= de montagne), souvent caractérisées par des niches écologiques restreintes, ou une faible compétitivité. De ce fait, cette région, dont la biodiversité est particulièrement menacée du fait des modifications écosystémiques créées par les activités humaines, est d'une importance critique en terme de conservation. Cependant, les espèces alpines communes ont des Histoires variées, qui souvent leur sont propres. Leur répartition actuelle, en partie modelée par les changements climatiques majeurs, particulièrement au cours du Pléistocène, a besoin d'un regard décentré par rapport au présent, afin d'être comprise.
Tout au long de cette thèse, j'ai tenté de comprendre les dynamiques anciennes et récentes des plantes alpines calcicoles, et plus particulièrement des espèces présentes, encore aujourd'hui, au sein de stations relictuelles, nichées dans les massifs périphériques alpins. A l'aide d'un large échantillonnage et d'un ensemble d'analyses génétiques et métabolomiques, je tente d'approfondir la compréhension de l'organisation actuelle du complexe de Primula auricula à travers les Alpes, et de déterminer le rôle joué par les refuges périphériques alpins dans la répartition actuelle des communautés de plantes alpines (chapitre I). Je tente aussi de définir les dynamiques récentes du groupe dans le massif nord des Alpes et ses périphéries, qui restent peu étudiées en phylogéographie alpine, à l'aide d'analyses génomiques (chapitre III). Pour finir, j'explore de nouvelles approches d'analyses génomiques pour essayer de mieux comprendre les dynamiques récentes de la flore alpine dans les Alpes du Nord et leurs périphéries, régions qui restent très peu étudiées en phylogéographie alpine. J'ai aussi tenté de trouver de nouvelles approches pour discriminer les lignées phylogénétiques récentes au sein de ces taxons (chapitre II).
Le chapitre I de ce travail vise à démêler la phylogéographie du complexe Primula auricula à travers les Alpes au sens large. Durant l'époque du Pléistocène, et en particulier de ses évènements glaciaires, la majorité des Alpes était recouverte par des mètres de glace. Il en découle que la majorité de la flore alpine actuelle ne pouvait alors pas subsister sur place ; sans compter sur un nombre restreint d'espèces qui sont capables de résister à de très basses températures ainsi qu'à une aridité extrême dans des refuges hypothétiques nommés « Nunataks ». La plus grande partie des espèces pouvaient alors subsister au sein de refuges hypothétiques dans les plaines, qui offraient des conditions de vie plus douces. Les espèces montagneuses constituent un cas particulier, puisque certains taxons étaient capables de subsister en marge des glaciers, au sein de refuges hypothétiques périphériques, créant potentiellement des populations séparées géographiquement.
La plus grande partie des études de phylogéographie alpine floristiques se concentrent sur l'arc alpin dans sa définition la plus stricte. Cependant, les massifs et plaines périphériques nord-alpins abritent de nombreux refuges microclimatiques, dans lesquels plus de 70 espèces alpines ont pu être recensées, dont le complexe de Primula auricula, et qui pourraient être le siège d'une biodiversité cryptique.
Afin de définir comment et quand P. auricula a gagné les périphéries alpines et en particulier celles situées au nord du massif, j'ai utilisé une approche complémentaire associant des reconstructions phylogénétiques, des analyses de regroupement populationnels et des essais de datation sur des données génétiques obtenues grâce à la technique de ddRADseq. Je démontre, que le complexe de P. auricula est formé de trois clades distribués à travers les Alpes, et au sein desquels des sous-clades et leurs répartitions géographiques ont été modelés par les évènement glaciaires qui ont pris place durant le Pléistocène, et par la configuration du paysage alentour. Les populations situées dans le sud et dans l'est des Alpes montrent majoritairement des schémas de distribution qui reflètent une isolation géographique au long-terme, tandis que les populations situées au nord et à l'ouest des Alpes reflètent un plus grand dynamisme, qui comprend la présence de grandes populations interconnectées durant les époques glaciaires, et des périodes d'isolation géographique durant les époques interglaciaires. De plus, une forte dérive génétique a récemment pris place dans les régions périphériques du Dévoluy et du Vercors.
Le chapitre II de ce travail se concentre sur la recherche de nouvelles approches visant à discriminer les évènements récents de diversification au sein du complexe de P. auricula.
Les évènements successifs d'isolation géographique en zones déglacées et de nouveaux contacts lors des retraits glaciaires ont façonné l'organisation génétique de cette espèce à travers les Alpes. Certaines lignées sont actuellement considérées comme des espèces différentes par certains auteurs. Cependant, les critères morphologiques permettant de distinguer ces groupes ne sont pas clairs, et ont été sujet de débats dans la littérature. Ce problème est communément rencontré au sein des lignées de plantes alpines, qui se diversifient couramment par allopatrie, mais gardant des morphologies très similaires. Je tente de trouver une nouvelle méthode de discrimination phénotypique au sein du complexe en analysant la composition métabolomique de l'espèce de manière globale, et en déterminant des superclasses de composés chimiques discriminantes. Cette méthode, facile à implémenter et peu coûteuse pourrait être utile pour différencier la biodiversité cryptique, lorsqu'une discrimination morphologique ne peut pas être utilisée. Je démontre que la variabilité génétique au sein du complexe de P. auricula est corrélée à une variabilité métabolique. En particulier, les évènements de dérive génétique marqués et récents, comme celui observé dans les régions du Vercors et du Dévoluy, ont conduit à d'importants changements chimiques. La différenciation chimique des lignées plus anciennement séparées sont plus subtiles, et nécessitent des analyses qualitatives pour pouvoir être discriminées.
Le chapitre III de ce travail explore de nouvelles approches génomiques et permet d'approfondir la compréhension des dynamiques spatio-temporelles récentes au sein du complexe de P. auricula à travers la partie nord des Alpes et ses périphéries.
Ce dernier chapitre vise à offrir une première vision du dynamisme de la flore des Alpes au sein de ces massifs. Les projections climatiques passées ont souvent présenté les massifs périphériques au nord des Alpes comme abritant des steppes arides durant les glaciations, considérées comme étant inhospitalières pour la majorité des communautés alpines.
Malgré tout, plusieurs espèces alpines dont le complexe P. auricula sont présentes dans ces zones. À première vue, très homogène génétiquement en comparaison des populations situées au sud des Alpes, le complexe P. auricula présente une organisation géographique intéressante dans cette région lorsque l'on utilise un échantillonnage dense. En plus d'une forte dérive génétique sur la périphérie ouest du massif alpin, les massifs périphériques constitués du Jura et du plateau suisse semblent se détacher phylogénétiquement du massif alpin sensu stricto. En utilisant une approche d'inférence démographique, et en recoupant les résultats obtenus avec des tests d'hybridation, je tente d'offrir une première vision du dynamisme structuré de ce complexe sur le Nord des Alpes, à travers le temps et l'espace. Je tente de comprendre si le complexe a pu résister dans une ou plusieurs populations durant les époques glaciaires. Je tente également d'identifier les événements d'hybridation entre les différentes lignées, qui peuvent potentiellement brouiller la reconstruction phylogénétique générale du taxon. Ce dernier chapitre, exploratoire, offre un aperçu de méthodes prometteuses et encore en développement qui permettront, espérons-le, d'évaluer la biodiversité et l'histoire de nombreux taxons, en se passant de génome de référence.
Durant cette thèse, j'ai pu démontrer que les régions périphériques nord-alpines ont certainement constitué un refuge glaciaire dynamique durant le Pléistocène, et ont pu permettre la recolonisation du nord des Alpes centrales. Le complexe de P. auricula est constitué de trois lignées monophylétiques dans les Alpes, qui sont séparées par des barrières physiques et historiques, et qui ont des histoires diverses. Les patrons génétiques de ce taxon se reflètent à travers son métabolome, qui apparaît comme une approche prometteuse pour permettre de discriminer les événements de diversification récents et cryptiques, communs chez les plantes alpines.

ABSTRACT
The Alps and their alpine environment constitute the primary habitat of many mountain plant species with narrow ecological niches or limited competitive abilities. As this region is particularly threatened by human-driven ecosystem changes, it holds high conservation value. However, many widespread alpine species have complex histories of colonization, recolonization, and persistence. Understanding their current distribution therefore requires a broader perspective that integrates global climatic fluctuations, especially the Pleistocene glaciations, which profoundly shaped present-day distribution patterns.
In this thesis I investigate the historical and recent diversification dynamics of calcicolous alpine plants occurring in relict populations along the combined with genetics and metabolomics approaches, I examine the spatial organization of the Primula auricula complex across the Alps and assess the role of peripheral refugia in shaping contemporary alpine plant communities (Chapter I). I further employ recent genomic approaches to disentangle the spatio-temporal dynamics of alpine plants in the northern Alps and their peripheries, regions that remain understudied in alpine phylogeography (Chapter III). Finally, I evaluate novel molecular and metabolomic tools to discriminate among recently diverged evolutionary lineages of alpine taxa (Chapter II).
In Chapter I, I reconstruct the phylogeography of the Primula auricula complex across the Alps sensu lato. During the Pleistocene glaciation events, much of the central Alps was covered by meters of ice sheet, preventing the in situ survival of most alpine flora. Only a limited number of species could persist in 'Nunatak' glacial refugia. The majority of the species occurred in so-called 'lowland glacial refugia', where milder conditions occurred. Montane species are a special case as some could survive both inside and at the periphery of glaciated regions (the 'peripheral glacial refugia'), eventually creating geographically separated populations. The current phylogeographic research on alpine plants mainly focus on the alpine ark strictly defined. However, the northern lowland peripheries of the Alps comprise many cold microclimatic refugia where more than 70 alpine species were recorded, including the P. auricula complex, and which might be home to cryptic biodiversity. I use a complementary approach of phylogenetic reconstructions, population clustering analysis and dating trial of divergence times on ddRADseq genetic data to define when and how the P. auricula complex reached the alpine peripheries, with a particular focus on the the largely unstudied northern peripheries of the Alps. I demonstrate that three main clades constitute the P. auricula complex across the Alps, in which subclades and their current repartition were shaped by the past Pleistocene glacial events and landscapes conformations. The southern and eastern alpine populations mainly display long-term isolation patterns, while the northern and western alpine population reflects a higher dynamism, comprising large interrelated populations during glacial events, and geographic isolation state during warm times. Moreover, a recent strong genetic drift occurred in the external Dévoluy and Vercors regions of this clade.

In Chapter II, I explore phenotypic approaches to discriminate among recently diverged lineages of the P. auricula complex. Successive isolation in deglaciated areas and secondary contact following glacier retreat structured the current genetic diversity of this group. Although several lineages have been proposed as distinct primarily by allopatry and showing limited morphological divergence. Using a metabolomics approach with large broad compound screening and precise discrimination of superclass of chemical compounds, I evaluate cost-effective and easily implementable methods to detect cryptic biodiversity when morphological differentiation is minimal. I demonstrate that genetic and phylogenetic patterns observed in the P. auricula complex across the Alps correlate with the chemical product of the plants. Particularly, the strong and recent genetic drift such as the one experienced in the Vercors and Dévoluy regions lead to strong chemical differentiation. Chemical differentiation of lineages with long term isolation patterns are buffered but can be assessed thanks to qualitative analysis.
In Chapter III, I apply novel genomic approaches to investigate recent spatio-temporal dynamics inside the P. auricula complex across the northern Alps and peripheries. In past climatic studies, these regions were projected as arid steppes during glaciation times. Consequently, they were for long considered as unsuitable for common alpine communities' subsistence. A widely extended clade inside the P. auricula is present across the northern Alps, the western Alps and its peripheries. Although this lineage appears genetically homogeneous compared to southern clades, dense sampling reveals clear geographic structuring. Peripheral populations in the Jura Mountains and the Swiss Plateau show divergence from populations in the northern Alps sensu stricto, alongside strong differentiation in parts of the western Alps. Using a demographic inference approach, coupled with hybridization tests, I assess whether one or multiple populations persisted in the northern Alps during glacial maxima and identify gene flow events that may obscure phylogeographic patterns. This exploratory chapter highlights promising genomic approaches for reconstructing the evolutionary history and biodiversity of non-model organisms in the absence of a reference genome.
Overall, this thesis demonstrates that the northern Alpine peripheries acted as dynamic glacial refugia during the Pleistocene and contributed to the recolonization of the northern central Alps. The Primula auricula complex consists of three distinct and monophyletic Alpine lineages separated by historical and geographic barriers, each with a unique evolutionary history. Genetic patterns are mirrored by metabolomic differentiation, supporting metabolomic fingerprinting as a promising tool for detecting recent and cryptic diversification in alpine plants. Future phylogeographic studies of calcareous alpine plants should incorporate northern lowland peripheral regions, as these areas represent a crucial component of their glacial history. Furthermore, the development of open-access chemical libraries and the integration of metabolomics into demographic modeling represent promising directions for advancing our understanding of alpine plant diversification.

PhD thesis supervisors:
Prof. Sergio Rasmann, University of Neuchâtel, Switzerland
Prof. Nadir Alvarez, University of Lausanne, Switzerland
Prof. Jason Grant, University of Neuchâtel, Switzerland

PhD thesis committee:
Dr. Jérémy Gauthier, Naturéum, Lausanne, Switzerland
Prof. Florian Boucher, University of Grenoble, France

Defended on February 5, 2026

No de thèse : 3248