Identification et caractérisation de protéines antigéniques de 'Borrelia burgdorferi' sensu lato

<i>Borrelia afzelii</i>, <i>B. garinii</i>, et <i>B. burgdorferi</i> sont trois des cinq espèces de <i>Borrelia</i> définitivement reconnues comme responsables de la borréliose de Lyme en Europe. Cette maladie infectieuse est transmise par les tiques et se caractérise par des symptômes multiples en plusieurs étapes touchant le derme, les articulations, le système neurologique et cardiaque. Le but de cette étude est de révéler de nouvelles protéines antigéniques spécifiques de <i>B. burgdorferi</i> sensu lato et de les caractériser. L’'intérêt serait d’améliorer la détermination sérologique, la PCR de routine, et le diagnostic médical (symptômes / antigènes particuliers). <br> Dans cette étude, deux approches globales ont été utilisées pour étudier les protéines antigéniques d'intérêts: une démarche protéomique et une démarche génomique. La partie protéomique consiste à étudier l’immunoprotéome de chaque espèce pathogène. Les fractions antigéniques des lysats protéiques totaux de <i>B. burgdorferi</i> sensu stricto VS215, <i>B.garinii</i> VS102 et <i>B. afzelii</i> VS461 ont été préparées en utilisant différentes colonnes d’immuno-affinités ayant une réactivité sérologique spécifique. Les protéines ont ensuite été séparées par électrophorèse bidimensionnelle pour obtenir des cartes de références spécifiques à chacune des espèces. 4 spots spécifiques ont été observés pour <i>B. afzelii</i> et 2 pour <i>B. burgdorferi</i>. <br> La partie génomique consiste à étudier le protéome prédit de chaque espèce. Des algorithmes bioinformatiques ont été utilisés et une méthode a été décrite pour sélectionner les protéines potentiellement sécrétées par <i>B. afzelii</i>, <i>B. burgdorferi</i> et <i>B.garinii</i> (méthode rapide, facile et librement disponible à partir d’internet). Cette sélection a mis en évidence 3 candidats pour <i>B. afzelii</i>, 7 pour <i>B. burgdorferi</i> et 2 pour <i>B.garinii</i>. <br> Ces deux approches donnent une vue de l’ensemble des antigènes de <i>B. burgdorferi</i> s.l. <br> Finalement un exemple d’identification et de caractérisation de candidat a été faite. L'objectif de cette étude était d'identifier une protéine de 12 kDa de <i>B. garinii</i> réagissant avec l’anticorps monoclonal D6. La protéine a été extraite et soumise à une analyse de séquence LC-MS/MS. Cette analyse a révélé trois séquences polypeptidiques analogues à BB0477 (30S ribosomique S10), à BB0061 (thiorédoxine A), et à BB0390 (50 S ribosomique L7/L12). <br> Les analyses génétiques ont été réalisées et deux polypeptides de la thiorédoxine A et un de la protéine ribosomique 50S ont ainsi été identifiés comme des épitoques potentiels. <br> L’expression dans le vecteur PQR9 de <i>E. coli</i> suivie d’immunoblots a permit de montrer que les résidus 7-12 de la thiorédoxine A. sont reconnu par le D6. Cela a été confirmé par des expériences de compétition avec un peptide synthétique., <i>Borrelia afzelii</i>, <i>B. garinii</i>, and <i>B. burgdorferi</i> are three of the five Borrelia species definitely recognized as responsible for Lyme borreliosis in Europe. This infectious disease is transmitted by ticks and is characterized by multistage skin, joint, neurological and cardiac manifestations. The aim of the present study is to reveal new species specific proteins of <i>B. burgdorferi</i> sensu lato and to characterize them. The points of interest consist in serologic determination, routine PCR, chips technology and in medical diagnostic (symptoms / particular antigen). <br> In this study, two global approaches were used to study antigenic proteins of interest: the proteomic way and the genomic way. The proteomic part consists to study the immune-proteome of each pathogenic genospecies. Antigenic fractions of total bacterial protein lysate of <i>B. burgdorferi</i> sensu stricto VS215, <i>B.garinii</i> VS102 and <i>B. afzelii</i> VS461 were prepared using different immune-affinity columns with specific serological reactivity. Proteins were then separated by two-dimensional electrophoresis to obtain specific reference map for each species. 4 specific spots were observed for <i>B. afzelii</i> and 2 for <i>B. burgdorferi</i>. <br> The genomic part consists to study the predicted proteome of each genospecies. Bioinformatic algorithms were used and a method was described to select potential secreted proteins from <i>B. afzelii</i>, <i>B. burgdorferi</i> and <i>B.garinii</i> proteome in a simple way (fast, easy and freely available from internet). At the end of selection, 3 candidates were found for <i>B. afzelii</i>, 7 for <i>B. burgdorferi</i> and 2 for <i>B.garinii</i>. <br> These two approaches resume the antigenic state of <i>B. burgdorferi</i> s.l. <br> Finally an example of identification and characterisation of such candidates was made. The objective of this study was to identify a12 kDa protein from <i>B. garinii</i> reacting with the D6 monclonal antibody. Protein was extracted and submitted to LC-MS/MS sequence analysis. This analysis revelead three polypeptide sequences analogous to BB0477 (30S ribosomal protein S10), BB0061 (thioredoxine A), and BB0390 (50 S ribosomal protein L7/L12). <br> Genetic analyses were performed and two polypeptides from thioredoxin A and one from 50S ribosomal protein were thus identified as potential epitopes. Expression in <i>E.coli</i> PQR9 followed by by immunoblotting identified residues 7-12 of thioredoxin A as the D6 mab epitope. This was confirmed by competition experiments with a synthetic peptide.

Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel, 2012