Molecular functional characterization of appetence maturation and its nutrient-dependent control in the African malaria mosquito “Anopheles gambiae” - Arsic, Dany (My University, 2008)
Le moustique Anopheles gambiae (anophèle) est le principal vecteur du paludisme (malaria) en Afrique sub-saharienne. Les repas sanguins fréquents pris par les femelles adultes sur des êtres humains multiplient les occasions de transmission des parasites sanguins du genre Plasmodium responsables du paludisme. Une meilleure compréhension de la régulation des comportements de recherche d’hôte entrepris par les moustiques femelles, ainsi que de leurs comportements alimentaires et de leur reproduction est une condition indispensable à l’avancement de la recherche visant à réduire la transmission du paludisme. Dans cette étude, nous avons premièrement cherché à mieux comprendre la maturation de l’appétence des femelles anophèles pour un hôte. Nous avons enregistré leur attirance nocturne vers un corps chaud au cours des premiers jours de leur vie adulte. Puis, nous avons suivi une approche de génomique fonctionnelle visant à détecter d’éventuelles corrélations entre l’attirance et l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la régulation des comportements de recherche d’hôte. L’appétence des femelles anophèles a montré une augmentation exponentielle avec l’âge des moustiques avec un saut particulier entre les jours 4 et 5. Cela correspond à la période à laquelle les réserves de glycogène ont sensiblement baissé de leur valeur maximale des jours 1-2 et où les réserves de lipides sont au maximum, ce qui pourrait refléter un état de maturité « optimale » du moustique en vue de la production d’oeufs. Nos résultats ont révélé que les niveaux de transcrits des gènes period (per), insulin-like peptide 4 (ilp4) et p70 s6 kinase (s6k) étaient positivement corrélés à l’âge et, donc, à l’appétence, mais n’étaient pas plus élevés chez les moustiques appétants âgés d’un jour comparés aux non-appétants du même jour. Cela suggère que l’expression de ces gènes n’est pas seulement liée au comportement, mais nécessite une maturation et peut-être aussi une insémination. Nous spéculons que les niveaux d’ARNm de per augmentent dans le cerveau en anticipation des tâches de recherche de nourriture. Le catabolisme du glycogène qui a lieu après le jour 2 pourrait occasionner une augmentation du glucose disponible, stimulant la transcription d’ilp4. Cette étude a aussi eu pour but d’identifier les facteurs décisifs déclenchant l’oogenèse et l’inhibition concomitante du comportement de recherche d’hôte. Pour ce faire, nous avons mesuré l’effet d’aliments de différentes natures chimiques et valeurs nutritionnelles sur les comportements de nourrissage, la propension à piquer après un repas, et sur le développement des follicules ovariens 24 heures après le repas de femelles anophèles. Dans l’optique de manipuler la sensation qu’a le moustique de son propre état nutritionnel, nous avons aussi testé l’effet de la distension abdominale sur le comportement de recherche d’hôte. Cette étude montre que le mode d’ingestion normalement évoqué par le sang peut être induit par une combinaison de facteurs physico-chimiques et ne requiert pas la présence d’acides aminés ou de protéines dans l’aliment. Nous démontrons que l’induction de ce mode d’ingestion résulte en l’inhibition du comportement de piquer après le repas. La distension de l’estomac (intestin moyen) pourrait être le médiateur-clé de ce phénomène, puisque le remplissage artificiel de l’estomac par injection anale (enema) de solution saline provoque aussi l’inhibition du comportement de piquer. De plus, nous établissons qu’une certaine concentration de protéine dans le repas est nécessaire et suffisante pour commencer l’oogenèse, mais seul le sang a permis le dévelop-pement complet des oeufs dans nos expériences, ce qui prouve que le moustique femelle doit trouver d’autres composés essentiels à partir d’un hôte. Comment le moustique sait s’il a faim ou s’il est repu est une autre question posée dans ce travail. Nous avons mesuré l’effet d’aliments de différentes natures chimiques et valeurs nutri-tionnelles sur la réponse précoce des gènes target of rapamycin (tor), s6k, tuberous sclerosis complex 2, insulin receptor, ilp3 et ilp4 dans des femelles anophèles quelques heures après le repas. Les effets sur l’expression de ces gènes de repas composés soit de sucre, de solution saline ou d’albumine additionnée d’acides aminés ont été déterminés par PCR quantitative en temps réel dans des extraits de têtes et d’abdomens. L’activité des enzymes TOR et S6K dans l’ovaire et le cerveau à la suite de ces repas ou d’un repas sanguin a été déterminée par la détection des formes phosphorylées de ces enzymes par la technique du western blot en utilisant des anticorps spécifiques. De plus, l’effet de ces différents nutriments sur la présence et l’activité de ces deux enzymes a été déterminé dans l’ovaire et le cerveau par immunohisto-chimie. En fait, le niveau d’enzymes S6K qui sont phosphorylées sur le résidu thréonine 398 (chez la drosophile) ou 389 (site homologue chez les mammifères) est une mesure de l’activité de l’enzyme TOR. Nous montrons que les niveaux de transcrits de s6k et de membres de la voie de l’insuline sont rapidement affectés par les nutriments ingérés par l’anophèle (surtout ilp3 dans la tête), et que la voie TOR / S6K est capable de réagir rapidement à tout repas par une augmentation de la phosphorylation de TOR et S6K. Qui plus est, nous montrons que l’étendue de cette activité de signalement dépend de la valeur nutritive réelle du repas. L’immuno-localisation de ces enzymes fournit des informations sur la question très débattue de leur localisation sub-cellulaire et documente ce que nous interprétons comme des signes de communication inter- et intra-cellulaire dans des cellules folliculaires., Anopheles gambiae mosquitoes are the main vector of human malaria in sub-Saharan Africa. The frequent blood meals taken by female An. gambiae increase the transmission of Plasmodium blood parasites. A better understanding of the regulation of host-seeking and feeding behaviors in this mosquito is a prerequisite for further efforts to cut malaria transmission. Our first aim was to portray better the maturation of appetence for a host in female An. gambiae. We addressed host-seeking behaviors by recording the nocturnal attractedness to a warm body on the first days of adult life. Then, we implemented a functional genomics approach which assayed potential correlation between appetence and the expression of candidate genes implicated in the regulation of host-seeking behaviors. The appetence of An. gambiae females was shown to increase exponentially with age, with a marked increase between days 4 and 5, at least in the tested conditions. This corresponds to the period at which glycogen stocks have well decreased from peak values at days 1-2 and lipids stocks are at highest levels, which could reflect an “optimal” maturity of the mosquito for oogenesis. Our results revealed that the transcript levels of period (per), insulin-like peptide 4 (ilp4) and p70 s6 kinase (s6k) were positively correlated to age and thus, to increasing appetence, but were not higher in attracted than in non-attracted mosquitoes on day 1. This suggests that the expression level of these genes is not only linked with behavior, but requires maturation and maybe also mating. We speculate that the levels of brain per mRNA increase in anticipation of the challenges of foraging. Glycogen catabolism taking place after day 2 could result in an increase of available glucose, which could trigger ilp4 transcription. This study aimed also at identifying the critical factors triggering oogenesis and the concomitant inhibition of host-seeking behavior. Therefore we assessed the effects of diets of different chemical nature and nutritive value on female An. gambiae feeding behaviors, post-prandial willingness to bite, as well as on the development of ovarian follicles 24 h after the meal. We also tested the effect of abdominal distention on host-seeking behavior in an attempt to manipulate the sensation that the mosquito has of its own nutritional state. This study reports that blood-like feeding can be induced by a combination of physico-chemical factors and do not require the presence of amino acids or proteins in the diet. We show that once this feeding mode has been induced, post-meal biting is inhibited. Midgut distention may be a key mediator of this phenomenon, as saline enemas were able to inhibit biting as well. Moreover we demonstrate that a certain concentration of protein in the meal is needed and sufficient to trigger the start of oogenesis, but only blood allowed full egg development in our assays, which proves the need for the female mosquito to find other essential compounds from a host. Another question addressed in this work is how the mosquito knows it is hungry or satiated. We assessed the effects of diets of different chemical nature and nutritive value on the early response of target of rapamycin (tor), s6k, tuberous sclerosis complex 2, insulin receptor, ilp3 and ilp4 in An. gambiae females a few hours after different meals. The effects of albumin plus amino acids, sucrose and saline on the expression of these genes were determined by quantitative real-time PCR in head and abdomen extracts, and the activity of TOR and S6K in the ovary and brain following these meals or a blood-meal was determined by immunoblotting of phosphorylated TOR and S6K. In addition, the effect of these nutrient types on the presence and activity of both enzymes in ovarian and brain cells was determined by immunohistochemistry. Indeed, the level of S6K proteins that are phosphorylated on Drosophila threonine 398 (and the homologous threonine 389 in mammals) is a measure of TOR activity. We show that transcript levels of s6k and members of the insulin pathway are readily affected by nutrients in An. gambiae (especially ilp3 in the head) and that the TOR / S6K pathway is able to react rapidly to any meal by increasing TOR and S6K phosphorylation. Further, we show that the extent of this signaling activity depends on the true nutritive value of the meal. Immunolocalization of these enzymes provides data on the debated question of their sub-cellular localization and documents what was interpreted as signs of inter- and intra-cellular communication in follicular cells.
Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel, 2008 ; Th.2021
Keywords: Anopheles gambiae; recherche d’hôte; mode de nourrissage; repas sanguin; repas de nectar; destination anatomique du repas; oogenèse; ovaire; cerveau; intestin moyen; signalement nutritionnel; period; takeout; target of rapamycin; p70 S6 kinase; insulin-like peptide; insulin receptor; expression des gènes; PCR quantitative en temps réel; western blotting; immunohistochimie; paludisme; hématophagie; Anopheles gambiae; host-seeking; feeding mode; blood feeding; sugar feeding; diet destination; oogenesis; ovary; brain; midgut; nutritional signaling; period; takeout; target of rapamycin; p70 S6 kinase; insulin-like peptide; insulin receptor; gene expression; quantitative real-time PCR; western blotting; immunohistochemistry; malaria; hematophagy