Etude du mécanisme de la porphobilinogène synthase de Pseudomonas aeruginosa: synthèses, études cinétiques et structures déterminées à l’aide des rayons X d’analogues de bisubstrats - Gacond, Sabine (My University, 2005)
Ce travail est basé sur l'obtention d'informations sur le mécanisme adopté par l'enzyme porphobilinogène synthase (PBGS, EC 4.2.1.24). La porphobilinogène synthase est impliquée dans la biosynthèse des produits tétrapyrroliques naturels tel que la chlorophylle, l'hème, la vitamine B12, etc. Ces pigments tétrapyrroliques jouent un rôle important dans des processus fondamentaux de la vie (photosynthèse, transport de l'oxygène dans le sang, etc.) et c'est pourquoi ils ont été appelés " pigments de la vie ". La PBGS effectue la condensation non symétrique de deux molécules d'acide 5-aminolévulinique (ALA) en porphobilinogène (PBG). Cette réaction enzymatique implique la formation de deux nouvelles liaisons entre les deux molécules de substrat : une liaison C-C et une liaison C-N. Deux mécanismes ont donc été proposés dépendant de l'ordre de formation de ces deux liaisons : formation d'une première liaison C-C (réaction de type aldol) ou formation d'une première liaison C-N (formation d'une base de Schiff) entre les deux molécules de substrat. Afin d'obtenir des informations sur le mécanisme enzymatique, deux techniques ont été utilisés : l'étude cinétique et la co-cristallisation d'inhibiteur avec la PBGS. Pour ce faire, une nouvelle série d'analogues de bisubstrat, contenant les fonctions carboxylates et cétones nécessaires pour une bonne reconnaissance au site actif de l'enzyme, a été créée. Ces dimères symétriques dérivant de l'acide lévulinique ont été synthétisés afin d'imiter la liaison des deux substrats au site actif de la PBGS. Différents hétéroatomes sont utilisés pour lier les deux unités acide lévulinique afin de tester l'influence de leur taille et de leur polarité sur leur potentiel à inhiber la PBGS. Dans un premier temps, les potentiels d'inhibition des composés ont été caractérisés en déterminant les valeurs IC50 sur la PBGS issue de Pseudomonas aeruginosa. Puis les tests cinétiques ont été effectués afin de déterminer les constantes d'inhibition et le type d'inhibition. L'hétéroatome, reliant les deux unités acide lévulinique, a une grande influence sur le comportement de l'inhibition des nouveaux composés. Les structures aux rayons X de l'enzyme co-cristallisée avec les différents inhibiteurs, apportent de nouvelles informations sur le mécanisme de la PBGS. Les inhibiteurs qui sont liés par deux bases de Schiff dans le site actif de la PBGS forment un intermédiaire cyclique par création d'une nouvelle liaison C-C intramoléculaire, analogue à celle observée dans le processus naturel. Les inhibiteurs qui ne sont liés que par une seule base de Schiff dans le site actif de l'enzyme ne forment pas la nouvelle liaison C-C. L'interprétation des ces résultats montre que la formation des deux bases de Schiff dans le site actif de l'enzyme semble être une condition nécessaire pour la formation de la nouvelle liaison C-C. De plus, il semblerait que la formation de cette liaison C-C nécessite une configuration la moins tendue possible de l'inhibiteur ou du substrat au site actif de l'enzyme. Toutes les informations apportées par les différentes structures aux rayons X des inhibiteurs synthétisés dans ce travail, favorisent nettement un des deux mécanismes de la PBGS : formation de la liaison C-C en premier, suivi de la liaison C-N entre les deux molécules de substrat naturel.
Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel, 2005 ; 1836
Keywords: Porphobilinogène synthase; Pseudomonas aeruginosa; synthèse de tétrapyrrole; analogue de bisubstrat; inhibiteur; structure cristalline; Porphobilinogen synthase; Pseudomonas aeruginosa; tetrapyrrole synthesis; bisubstrat analog; inhibitor; crystal structure