Functions of RMR proteins in intracellular trafficking in the moss "Physcomitrium patens" Mitten (previously "Physcomitrella patens") - Coppola, Carla (Neuchâtel, 2021)
Dans cette étude, je me suis concentrée sur une nouvelle famille des récepteurs, appelés RMRs (Receptor-like Membrane RING-H2) et j'ai essayé d'étudier leur rôle dans la mousse Physcomitrium patens Mitten (précédemment Physcomitrella patens).
Chez les Angiospermes, les protéines RMRs sont considérées des récepteurs vacuolaires pour la vacuole neutre/de stockage, un compartiment où les protéines de stockage et les métabolites s'accumulent pendant le développement des graines mais aussi dans des tissues somatiques. Elle se distingue de la vacuole lytique qui a les mêmes fonctions que les lysosomes animaux.
Les cinq gènes RMRs de la mousse ont été éliminés en produisant un matériel viable sans phénotype visible (Ayachi, 2012). Un phénotype intracellulaire a été décrit par Fahr (2017) qui a généré la construction Citrine-Cardosin (Ci-Card) composée de la protéine fluorescente Citrine fusionnée au déterminant d’adressage vacuolaire C-terminal (ctVSD) de la “cardosin A” (la cardosine est adressée à la vacuole chez les plantes supérieures — Pereira et al., 2013). La fluorescence a été détectée dans la vacuole centrale de P. patens sauvage mais faussement adressée au réticulum endoplasmique chez les lignées PpRMR-KO en indiquant que l’adressage à la vacuole de cette protéine dépend des PpRMRs.
L’introduction de cette thèse traite du système endomembranaire des plantes, avec une attention particulière au transport vacuolaire et à l'ubiquitination.
Dans le deuxième chapitre, je montre les techniques utilisées pour tenter de détecter les PpRMRs par immunotransfert: l’échec de détection est probablement dû à une dégradation rapide de ces protéines qui pourrait empêcher leur détection.
Dans le troisième chapitre, je me suis intéressée à l'implication des PpRMRs dans l'ubiquitination. Nous supposons que les PpRMRs sont des E3 ligases parce qu’elles sont membres de la famille des protéines PA-TM-RING. La plupart de ces protéines ont une activité de E3 ligase chez les animaux (Seroogy et al., 2004; Borchers et al., 2002), c’est pourquoi nous avons pensé que les PpRMRs pourraient également avoir cette fonction chez le plantes en contribuant ainsi au ciblage vacuolaire.
Les partenaires de PpRMRs étant inconnus dans la mousse, nous avons analysé des candidats en supposant qu'ils pourraient être ubiquitinés. Nous avons testé cette hypothèse par des tests d'ubiquitination par PpRMR2 in vitro, n’obtenant que des résultats ambigus.
Dans le quatrième chapitre, je montre des résultats préliminaires sur le phénotype visible de mutants KO des RMRs de la mousse : les lignées PpWT et PpRMR-KO ont montré des différences phénotypiques à niveau des gamétophores qui ont été accentuées lors d'une exposition au stress salin. Enfin, j'ai transformé les lignées transgéniques PpWT/Ci-Card et Pp5KO/Ci-Card avec des versions mutées de PpRMR2, et j’ai analysé leur effet sur le transport vacuolaire par microscopie confocale. Pour la plupart des constructions testées, le trafic a été perturbé dans les deux lignées. Seule la ligne PpWT/Ci-Card exprimant PpRMR2ΔSer (sans le motif riche en sérine) présentait un phénotype vacuolaire sauvage typique.
Abstract
In this study, I focused on a new family of receptors, called RMRs (Receptor-like Membrane RING-H2) and I tried to investigate their role in the moss Physcomitrium patens Mitten (previously Physcomitrella patens).
There is some evidence that in Angiosperms, RMRs are vacuolar receptors for the neutral/storage vacuole that is a compartment where storage proteins and metabolites are accumulated during seeds development or in somatic tissues. It is distinguished from lytic vacuole which has the same functions as animal lysosomes.
The five PpRMR genes have been knocked-out, yielding viable material without visible phenotype (Ayachi, 2012). A trafficking phenotype was described by Fahr (2017) who generated the construct Citrine-Cardosin (Ci-Card) composed of the fluorescent protein Citrine fused to the C-terminal vacuolar sorting determinant (ctVSD) from cardosin A (cardosin is addressed to the vacuole in higher plants —Pereira et al., 2013). The fusion protein was delivered to the central vacuole of PpWT but mistargeted in PpRMR-KO lines, indicating that the targeting of this protein to the vacuole depends on PpRMRs.
The introduction of this thesis presents the plant endomembrane system, with particular attention to vacuolar transport and ubiquitylation.
In the second chapter, I show the techniques used to attempt to detect PpRMRs by Western Blot: our failure may be due to a rapid degradation of these proteins, which could prevent their detection.
In the third chapter, I focused on PpRMR2 involvement in ubiquitylation. We hypothesize that PpRMRs are E3 ligases because they are members of the PA-TM-RING protein family. Most of these proteins have an E3 ubiquitin ligase activity in animals (Seroogy et al., 2004; Borchers et al., 2002), for this reason, we think that plant PpRMRs could have this function as well, which could contribute to vacuolar targeting. Indeed, I could confirm that PpRMR2 has an E3 ubiquitin ligase activity.
PpRMRs substrates are still unknown in moss thus we have analysed putative candidates supposing that they could be ubiquitylated by PpRMRs. We have tested this hypothesis through in vitro ubiquitylation assays, obtaining ambiguous results.
In the fourth chapter, I show preliminary results about the visible phenotype of PpRMR-KO mutants: PpWT and PpRMR-KO lines displayed phenotypic differences in leafy gametophores, which were accentuated upon salt stress exposure.
Lastly, I transformed the transgenic lines PpWT/Ci-Card and Pp5KO/Ci-Card with mutated versions of PpRMR2 and analysed their effect on vacuolar transport by confocal microscopy. For most of the constructions tested, the trafficking was perturbed in both lines. Only PpWT/Ci-Card expressing PpRMR2ΔSer (lacking the Serine-Rich motif) displayed a typical vacuolar pattern.
Doctorat, Université de Neuchâtel, Institut de biologie
Keywords: RMR; mousse; vacuole; « Physcomitrium patens » Mitten; « Physcomitrella patens »; ubiquitination; E3 ligase; phénotype; microscopie confocale; test « in vitro »; stress salin; RMR; moss; vacuole; “Physcomitrium patens” Mitten; “Physcomitrella patens”; ubiquitylation; E3 ligase; phenotype; confocal microscopy; “in vitro” assay; salt stress