A novel nano-optical sensing approach for real-time amyloid aggregation monitoring - Santi, Sara (My University, 2016)
Le repliement incorrect et l’agrégation des protéines amyloïdes ont été associés au développement de maladies incurables comme la maladie d’Alzheimer et de Parkinson. Dans le cas spécifique de la maladie d’Alzheimer, des fibrilles matures et insolubles formées par l’agrégation du peptide « amyloïde-beta » (Aβ) sont un des éléments caractéristiques que l’on peut détecter dans le cerveau des patients affectés par cette pathologie. Durant de nombreuses années, ces fibrilles insolubles ont été considérées comme les principales responsables du développement de la maladie d’Alzheimer. Cependant, des études récentes ont révélé que la toxicité au niveau cellulaire du tissu neuronal est causée par des agrégats du peptide Aβ sous forme d’oligomères solubles, qui se forment pendant des premières étapes du processus d’agrégation, plutôt que par les fibrilles matures et insolubles. Les oligomères solubles du peptide Aβ sont difficile à identifier et à étudier, car les méthodes classiques de détection des amyloïdes ne sont pas assez sensibles pour pouvoir révéler leur formation. La recherche de nouvelles stratégies d’investigation du processus d’oligomérisation du peptide Aβ est désormais devenue impérative pour permettre de mieux comprendre les causes sous-jacentes du développement de la maladie d’Alzheimer, et de poser les bases d’un diagnostic précoce qui puisse être effectuée avant que les symptômes cliniques ne se manifestent.
Dans ce projet de thèse, nous explorons les propriétés uniques d’une plateforme optique de détection réfractométrique et « sans marqueur » afin de proposer une nouvelle approche à l’investigation des premières étapes du processus d’oligomérisation du peptide Aβ, couramment connu comme phase « lag» silencieuse. Notre approche permet la détection optique en temps réel des variations locales de l’indice de réfraction qui ont lieu une fois que l’agrégation commence. La méthode optique est basée sur l’interrogation d’un revêtement multicouche diélectrique (autrement appelée « cristal photonique à une dimension ») capable de soutenir une onde de surface électromagnétique, connue comme onde de surface de Bloch (Bloch Surface Wave, BSW). Les BSW générées par les revêtements multicouches diélectriques sont sensibles aux perturbations externes de l’indice de réfraction près de la surface du cristal photonique. Dans ce travail de thèse, nous apportons une preuve du principe de la technique basée sur les BSW pour la détection de l’agrégation du peptide Aβ42. Pour cela, nous suivons en temps réel la variation de l’indice de réfraction d’une solution aqueuse contenante le peptide Aβ42. Cette mesure est réalisée pendant les premières phases d’agrégation et de formation de fibrilles. La surface du revêtement multicouche est mise en contact direct avec la solution sondée. La surface sensible est positionnée verticalement. Le peptide Aβ42 est initialement injecté sous forme de monomère, et agrège progressivement jusqu’à former les fibrilles. Pendant ce processus, le peptide Aβ42 à tendance à précipiter loin de la surface du cristal photonique. Le capteur détecte uniquement un changement d’indice de réfraction dans un volume défini par la pénétration normale à la surface de l’onde évanescente du mode BSW qui est de l’ordre de 500nm. Par conséquent, la mesure d une diminution de l’indice de réfraction de la solution, laquelle est directement corrélée à la diminution de la concentration des monomères du peptide Aβ42 pendant leur agrégation.
Nous démontrons l’efficacité de l’approche BSW en suivant en temps réel les premières étapes cruciales de formation des oligomères toxiques du peptide Aβ42. Pour aborder la détection sélective de l’analyte, nous concevons une stratégie de modification et de fonctionnalisation chimique de la surface. Par ailleurs, nous apportons des nouvelles notions sur le mécanisme complexe d’agrégation du peptide Aβ42 en présence de petites sondes moléculaires qui sont capables d’interférer avec la dynamique de formation amyloïde. Comme moyen de contrôle, des méthodes spectroscopiques classiques, la microscopie à transmission électronique, le dosage de liaison avec la molécule fluorescente Thioflavine T, et des mesures basées sur la technique de RMN sont utilisées pour accomplir la caractérisation morphologique de l’échantillon investigué pendant son agrégation. Enfin, nous présentons une amélioration potentielle du système optique de base afin de simultanément effectuer une mesure de la diffusion de la lumière due aux agrégats. Ceci, avec comme but, d’investiguer en temps réel la variation en taille des agrégats du peptide Aβ42 durant la formation de fibrilles., The misfolding and aggregation of amyloid proteins has been associated with incurable diseases such as Alzheimer's or Parkinson's disease. In the specific case of Alzheimer's disease, insoluble mature fibrils formed of amyloid-beta (Aβ) peptide aggregates are one of the gross features detectable in brain of Alzheimer-disease-affected patients. Insoluble mature fibrils were for long time believed to be the main culprit of the pathology. Recent studies have shown that cell toxicity is caused by soluble oligomeric forms appearing in the early stages of aggregation, rather than by insoluble mature fibrils. Soluble Aβ oligomers are of difficult identification and study, since the classical amyloid detection techniques are not sensitive enough to reveal their formation. Research on new strategies to investigate Aβ oligomerization is imperative for the better understanding of the causes underlying the Alzheimer’s disease, and to set the basis for the diagnosis of the disease prior to the onset of clinical symptoms.
In this work, we exploit the unique properties of an optical label-free refractometric sensing platform to propose a novel approach for investigating the initial and silent–lag–phase of Aβ42 oligomerization. Our sensing approach allows the real-time optical detection of local refraction index changes occurring as aggregation takes place. The method is based on the optical interrogation of a dielectric multilayer (one-dimensional photonic crystal) sustaining an electromagnetic surface wave, called Bloch Surface Wave (BSW). BSWs generated on dielectric multilayers are sensitive to external perturbations of the refractive index close to the surface of the photonic multilayer. In this work, we report on a proof of principle of the BSW-based detection technique for sensing protein aggregation by monitoring in real time the refractive index variation of an aqueous solution containing the Aβ42 peptide during early aggregation and fibril formation. The multilayer surface is directly contacted with the probed aqueous medium and the sensing chamber is positioned vertically. Hence, we exploit BSWs to locally probe the refractive index variations of a solution wherein the Aβ42 peptide is initially injected in a monomeric form and is progressively aggregating to form fibrils. During this process, the Aβ42 peptide tends to precipitate away from the multilayered surface, therefore, the measurements using BSWs monitor a local variation of the refractive index of the solution, which is directly related to the depletion of the concentration of the Aβ42 monomeric form during aggregation.
We demonstrate the efficacy of the BSW approach by monitoring in real-time the first crucial steps of Aβ42 oligomerization. To address a selective sensing of the analyte, we devise a surface chemical functionalization strategy. Furthermore, we provide new insights into the complex mechanism of aggregation of this protein system in the presence of small molecular probes able to interfere with the dynamics of amyloid formation. As a control method, spectroscopic methods, Transmission Electron Microscopy, Thioflavin T binding assay, and NMR-based measurements are used to morphologically characterize the sample during aggregation. Finally, we present a potential improvement of the setup to perform a simultaneous light scattering measurement, with the purpose of real-time monitoring the size change of the Aβ aggregates, throughout fibrillization.
Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel, 2016
Keywords: Agrégation de protéines; maladie d’Alzheimer; peptide amyloïde-beta; bio-détection; cristaux photoniques; onde de surface de Bloch; Protein aggregation; Alzheimer’s disease, amyloid-beta peptide; biosensing; photonic crystals; Bloch surface wave