Identification moléculaire d'une chitinase CHT-1, sa localisation et son rôle chez le nématode 'Caenorhabditis elegans' - Azzouz, Fayçal (My University, 2001)
La présence des chitinases actives chez Caenorhabditis elegans n'est pas connu jusqu'à ce jour. Par contre F. Aleaddine dans son travail de thèse a pu démontrer une activité chitinolytique dans tous les stades de développement de ce nématode. En plus, un plasmide YK9 contenant un gène appelé cht qui présente certaines caractéristiques d'enzyme chitinase a été isolé et caractérisé (J.M. Neuhaus, communication personnelle). La séquence codante du gène cht a été donc amplifiée à partir de l'ADN complémentaire de C.elegans. La partie N-terminal avec le site catalytique conservé chez toutes les chitinases de la famille 18 a été trouvé. La partie C-terminal contenant deux domaines riches en cystéines qui sont liés entre eux et au domaine N-terminal par une région riche en thréonines est aussi présente. Ce gène classé comme une enzyme chitinase de la famille 18 a été nommé cht-1. Deux fragments FC 1 et DF amplifiés à partir de la séquence codante de cht-1 furent clonés, exprimés et purifiés. Deux anticorps anti-FC 1 et anti-DF ont été obtenus par l'immunisation des souris avec les deux protéines isolées. Une réactivité de l'anticorps anti-FC 1 avec deux bandes protéiques de 45 et 60 kDa fut révélée dans les stades de développement L1, L2, L3 et L4. Par contre une seule bande protéique de 45 kDa des mêmes stades a réagi avec l'anticorps anti-DF. Ces deux anticorps n'ont pas réagi avec les protéines de stades adultes et œufs de C.elegans. L'immunofluorescence fut utilisée pour localiser la chitinases CHT-1. En effet, l'anticorps anti-FC 1 a révélé une fluorescence au niveau de la bouche et du pharynx de C.elegans, alors que l'anti-DF a démontré une importante fluorescence au niveau de la surface externe du nématode. L'immunocytochimie sur des coupes transversales du pharynx de C.elegans a démontré le marquage des canaux glandulaires avec l'anticorps anti-FC 1, selon Albertson et Thomoson (1976) ces trois canaux pourraient avoir un rôle dans la sécrétion des enzymes de digestions qui sont synthétisées par les cellules glandulaires (bulbe terminal). Alors que l'anticorps anti-DF a révélé un marquage aux grains d'or des cellules hypodermiques de ce nématode. J. E. Sulston et G. N Cox ont prouvé l'existence de plusieurs protéines riches en cystéines chez les nématodes et parmis eux C.elegans. Ceci pourrait permettre des réactions croisées de l'anticorps anti-DF avec ces protéines car cet anticorps a été produit contre la protéine (DF) de CHT-1 riche en cystéine. L'études fonctionnelle de la chitinase CHT-1 par la technique d'inhibition de l'ARN a été effectué sur deux populations de C.elegans nourris séparément avec des bactéries transformées. Sur l'aspect physiologique, les vers descendants n'ont subi aucune transformation détectable. Alors que sur l'aspect moléculaire, les anticorps anti-FC 1 n'ont réagi qu'avec la protéine d'environ 60 kDa et les anticorps anti-DF n'ont pas réagi avec les protéines totales des C.elegans transformées. Il apparait donc que, la protéine de 45 kDa pourrait être la chitinase CHT-1 reconnu par les anticorps anti-FC 1 et anti-DF. L'immunofluorescence réalisée avec l'anticorps anti-FC1 sur les vers transformés des deux populations a révélé l'absence de fluorescence au niveau du pharynx et sa présence au niveau de la bouche de ces nématodes. Ce résultat pourrait confirmer la synthèse de la chitinase CHT-1 par les cellules glandulaires, et sa sécrétion effectuée par les canaux glandulaires. La fluorescence détectée par l'anticorps anti-FC 1 au niveau de la bouche pourrait correspondre à une réaction croisée de ces anticorps avec la protéine de 60 kDa qui pourrait être la chitinase T13H5.3 homologue dans sa région N-terminal avec la protéine FC 1. La présence de la chitinase CHT-1 au niveau du pharynx pourrait avoir un rôle dans la digestion totale des structures chitineuses ainsi que la digestion partielle des chitosanes et des peptidoglycanes trouvés dans les bactéries ou dans d'autres organismes digérés par ces nématodes. Pour compléter ce travail, l'activité chitinolytique de ce gène cht-1 devrait être démontrée in-vivo et le rôle des autres chitinases connues devrait être étudié.
Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel, 2001 ; 1606