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Kessler, Félix

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Kessler, Félix
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Professeur ordinaire
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felix.kessler@unine.ch
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https://libra.unine.ch/handle/123456789/320

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    Characterization of domesticated clove ("Syzygium aromaticum") and comparison with related species
    (2024)
    Ouadi, Sonia 
    ;
    Kessler, Félix 
    ;
    Ivanov Nicolai
    Le giroflier, Syzygium aromaticum, est un arbre à épices appartenant à la famille des Myrtacées. Les boutons floraux encore fermés et séchés (clous de girofle), l'huile essentielle et l'oléorésine produits à partir du giroflier sont riche en eugénol et utilisés commercialement dans un large éventail d'industries. Malgré son importance économique et le potentiel thérapeutique prometteur de l'eugénol, peu de données omiques étaient disponibles pour la recherche fondamentale et appliquée sur le giroflier. Un génome de référence est un outil important pour l'avancement de la recherche en biologie végétale et des programmes d'amélioration des cultures. Dans le cadre de cette thèse, le génome du giroflier a été séquencé, et assemblé à l'échelle chromosomique, puis analysé en utilisant des approches de génomique comparative et multi-omiques dans le but d’étudier l'évolution du génome du giroflier et la base génétique de la biosynthèse de l'eugénol. Les assemblages des génomes de Syzygium malaccense (430 Mb), Syzygium aqueum (392 Mb), Syzygium jambos (426 Mb), et Syzygium syzygioides (431 Mb) ont également été construits pour être comparés aux génomes du giroflier (370 Mb), de Syzygium grande (405 Mb) ainsi qu’au génome d’une autre espèce de Myrtacées, Eucalyptus grandis (690 Mb), afin d'acquérir de nouvelles connaissances sur l'évolution des génomes des espèces de Syzygium. En analysant l'assemblage du génome du giroflier et en intégrant les données transcriptomiques et métabolomiques produites à partir des feuilles et des bourgeons floraux, les principales familles de gènes impliquées dans la biosynthèse des précurseurs de la lignine et des phénylpropènes volatils (eugénol, isoeugénol, chavicol) ont été identifiées ainsi que les gènes potentiellement impliqués dans la biosynthèse de l'eugénol. Sur la base de cette étude multiomiques, nous avons émis l'hypothèse que l'acétate d'eugénol pourrait jouer un rôle clé dans la forte accumulation d'eugénol dans les feuilles et les bourgeons floraux du giroflier. En outre, un nombre inférieur de gènes codant pour une possible eugénol synthase — une enzyme clé dans la biosynthèse de l'eugénol — ont été identifiés dans les génomes des 4 espèces de Syzygium nouvellement assemblés (1 à 3) que dans le génome du giroflier (15), suggérant que cette variation du nombre de copie peut être impliquée dans la teneur élevée en eugénol des organes de ce dernier. Les analyses de synténie ont révélé une bonne conservation de l'organisation chromosomique des 6 espèces de Syzygium étudiées et des réarrangements intrachromosomiques sur 7 des 11 chromosomes entre les espèces de Syzygium et E. grandis. Ces nouveaux génomes de Syzygium sont une contribution précieuse aux ressources génomiques de la famille des Myrtacées, et en particulier pour le genre Syzygium, le plus riche en espèces d’arbre au monde. De plus, la disponibilité d’un génome de référence pour le giroflier ouvre de nouvelles perpectives pour la recherche appliquée visant à optimiser la productivité des girofliers. ABSTRACT Clove, Syzygium aromaticum, is a valuable spice crop tree belonging to the Myrtaceae family. Its dried, unopened flower buds, essential oil, and oleoresin-rich in eugenol, are used commercially in a broad range of industries. Despite its economic importance and the promising therapeutic potential of eugenol, little -omics information was available for fundamental and applied research on clove. A reference genome is an important tool for the advancement of plant biology research and crop improvement programs. In this thesis, the clove genome was sequenced, assembled at the chromosome level and subsequently analysed using comparative genomics and multi-omics approaches to investigate clove genome evolution and the genetic basis of eugenol biosynthesis. In addition, the genome assemblies of Syzygium malaccense (430 Mb), Syzygium aqueum (392 Mb), Syzygium jambos (426 Mb), and Syzygium syzygioides (431 Mb) were constructed and compared to the genome assemblies of clove (370 Mb), Syzygium grande (405 Mb) and their Myrtaceae relative Eucalyptus grandis (690 Mb) to provide further genomic insights into the evolution of Syzygium genomes. By analysing the clove genome assembly and sets of transcriptomic and metabolomic data from leaves and buds, the key gene families involved in the biosynthesis of the precursor of lignin and phenylpropene volatiles (eugenol, isoeugenol, chavicol) were identified as well as genes possibly involved in the biosynthesis of eugenol. On the basis of this multi -omics study, we hypothesized that eugenol acetate may play a key role in the high accumulation of eugenol in clove leaves and buds. Fewer genes were found in the newly assembled Syzygium genomes (1 to 3) than in clove (15) to encode for putative eugenol synthase—a key enzyme in the eugenol biosynthetic pathway—suggesting that this copy number variation may be involved in the high content in eugenol of clove. Synteny analyses revealed a high conservation of the chromosomal organization of the 6 Syzygium species studied and intrachromosomal rearrangements on 7 of the 11 chromosomes, between the Syzygium species and E. grandis. This new set of Syzygium genomes is a valuable contribution to genomics resources for the Myrtaceae family, and especially to the Syzygium genus, the world’s most species-rich tree genus. Moreover, the availability of the clove reference genome opens new perspectives for applied research aiming to optimize clove production.
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    The atypical kinase ABC1K1 / PGR6 allocates geranylgeranyldiphosphate to the carotenoid biosynthesis pathway
    (2023)
    Zita, Wayne 
    ;
    Kessler, Félix 
    Les espèces fruitières cultivées jouent un rôle important dans la vie sur Terre. En effet, les fruits fournissent des nutriments et des vitamines essentiels qui ne sont pas synthétisés par l'homme mais qui sont nécessaires à sa santé. La synthèse de ces nutriments essentiels a lieu au cours du processus complexe de maturation et de mûrissement des fruits, orchestré par des gènes régulateurs, des facteurs de transcription et des hormones. Au cours de ce processus, de nombreux événements biologiques et physiologiques entraînent des changements dans les fruits et sont indispensables pour la couleur, la saveur, l'arôme et la qualité des fruits. Dans le fruit de la tomate, nombre de ces événements biologiques se produisent dans un plaste coloré spécialisé dans la biosynthèse et la séquestration des caroténoïdes, le chromoplaste. La couleur rouge caractéristique des fruits de la tomate est due à la synthèse et à l'accumulation de lycopène dans un compartiment lipoprotéique sous-organellaire des chloroplastes et des chromoplastes appelé plastoglobule (PG). Le noyau hydrophobe des plastoglobules des chloroplastes et des chromoplastes sert de réservoir et de compartiment de biosynthèse des esters de phytyle, des lipides prényliques et des caroténoïdes. Dans le premier chapitre intitulé "Plastoglobules : A hub of lipid metabolism in the chloroplast" (Shanmugabalaji et al., 2022), nous avons passé en revue les fonctions et le métabolisme des plastoglobules dans différents types de plastes. Dans le deuxième chapitre "Chapter II : Les plastoglobules du chromoplaste recrutent la voie de biosynthèse des caroténoïdes et contribuent à l'accumulation des caroténoïdes pendant la maturation du fruit de la tomate " (Zita et al., 2022), nous avons utilisé une approche protéomique pour étudier le remodelage du protéome des plastoglobules pendant la transition chloroplaste-chromoplaste dans le fruit de la tomate. Cette étude protéomique a révélé que le plastoglobule de la tomate contient environ 30 protéines et des membres de différentes familles d'enzymes dont les fibrillines (FBNs), l'activité du complexe BC1 kinase (ABC1Ks), la tocophérol cyclase (VTE1), la NAD(P)H-ubiquinone oxydoréductase C1 (NDC1). L'étude a révélé la présence de la voie complète de biosynthèse des caroténoïdes dans les plastoglobules du chromoplaste : phytoène synthase 1 (PSY1), phytoène désaturase (PDS), zeta carotène désaturase (ZDS), caroténoïde isomérase (CRTISO), et lycopène beta cyclase (LYC-B). Les résultats montrent que le plastoglobule devient une plateforme pour la biosynthèse des caroténoïdes pendant la transition chloroplaste-chromoplaste. En outre, les lipidomes du chloroplaste et du plastoglobule du chromoplaste subissent un remodelage au cours des étapes de maturation progressive du fruit. En particulier, le β-carotène et le lycopène sont fortement enrichis dans les plastoglobules du chromoplaste par rapport aux plastoglobules du chloroplaste. Dans l'ensemble, ce chapitre démontre que le plastoglobule joue un rôle central dans le processus de maturation. Dans le troisième chapitre "A quantitative method to measure geranylgeranyl diphosphate (GGPP) and geranylgeranyl monophosphate (GGP) in tomato (Solanum lycopersicum) fruit" (Zita et al., 2023), une méthode de quantification du GGPP à partir de tissus de fruits de tomates a été mise au point en utilisant la chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (UHPLC-MS/MS). La méthode a été validée en utilisant un type sauvage (WT) et des matrices mutantes défectueuses dans la synthèse du GGPP. En outre, ce chapitre souligne l'importance de la préparation des échantillons pour préserver le GGPP et limiter sa conversion en GGP (produit hydrolysé). Cette méthode est essentielle pour la suite de l'analyse dans ma thèse. Enfin, dans le quatrième chapitre de ma thèse "An atypical kinase ABC1K1 allocates geranylgeranyl diphosphate to the carotenoid biosynthesis pathway in plastoglobules of chromoplasts", j'étudie le rôle de SlABC1K1 dans le métabolisme des caroténoïdes du fruit de la tomate. Le mutant CRISPR-Cas9 de SlABC1K1 (slabc1k1) présente le phénotype photosynthétique PGR6 dans les feuilles qui avait été observé précédemment chez Arabidopsis. De manière surprenante, les fruits de slabc1k1 présentaient un phénotype orange. Le phénotype slabc1k1 est lié à une accumulation réduite de lycopène et de son précurseur, le phytoène. Sur la base de nos résultats, je propose deux scénarios possibles pour la fonction de SlABC1K1 dans les plastoglobules des fruits de tomate. SlABC1K1 peut agir comme un régulateur clé pour l'allocation du géranylgéranyl diphosphate (GGPP) à la voie des caroténoïdes ou comme un co-régulateur des enzymes de biosynthèse des caroténoïdes dans les plastoglobules. La découverte que SlABC1K1 est nécessaire pour l'allocation du GGPP au plastoglobule est le principal résultat de ma thèse. ABSTRACT Crop fruit species play an important role in life on Earth. Indeed, fruits provide essential nutrients and vitamins which are not synthesized by humans but are necessary for their health. The synthesis of these essential nutrients occurs during the complex process of fruit maturation and ripening, orchestrated by regulatory genes, transcription factors, and hormones. During this process, many biological, and physiological events lead to fruit changes and are indispensable for the fruit color, flavor, aroma and quality. In tomato fruit, many of these biological events occur in a colored plastid specialized in carotenoid biosynthesis and sequestration, the chromoplast. The hallmark red color of tomato fruit is due to the synthesis and accumulation of lycopene in a lipoprotein sub-organellar compartment of chloroplasts and chromoplasts called plastoglobule (PG). The hydrophobic core of chloroplast and chromoplast plastoglobules serves as a reservoir and biosynthetic compartment of phytyl esters, prenyl lipids and carotenoids. In the first chapter entitled “Plastoglobules: A hub of lipid metabolism in the chloroplast” (Shanmugabalaji et al., 2022) we reviewed plastoglobule functions and metabolism in different plastid types. In the second chapter “Chapter II: Chromoplast plastoglobules recruit the carotenoid biosynthetic pathway and contribute to carotenoid accumulation during tomato fruit maturation” (Zita et al., 2022), we used a proteomic approach to investigate plastoglobule proteome remodeling during the chloroplast to chromoplast transition in tomato fruit. This proteomic study revealed that the tomato plastoglobule contains around 30 proteins and members of different enzyme families including fibrillins (FBNs), the activity of BC1 complex kinase (ABC1Ks), tocopherol cyclase (VTE1), AD(P)Hubiquinone oxidoreductase C1 (NDC1). The study revealed the presence of the complete carotenoid biosynthesis pathway in chromoplast plastoglobules: phytoene synthase 1 (PSY1), phytoene desaturase (PDS), zeta carotene desaturase (ZDS), carotenoid isomerase (CRTISO), and lycopene beta cyclase (LYC-B). The results show that the plastoglobule becomes a platform for carotenoid biosynthesis during the chloroplast to chromoplast transition. In addition, the lipidomes of chloroplast and chromoplast plastoglobule undergo remodeling during progressive fruit ripening stages. Specifically, β-carotene and lycopene were highly enriched in chromoplast plastoglobules compared to chloroplast plastoglobules. Overall, the chapter demonstrates that the plastoglobule plays a central role in the ripening process. The third chapter “A quantitative method to measure geranylgeranyl diphosphate (GGPP) and geranylgeranyl monophosphate (GGP) in tomato (Solanum lycopersicum) fruit” (Zita et al., 2023), a method to quantify GGPP from tomato fruit tissue was developed using ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). The method has been validated by using a wild-type (WT) and mutant matrices defective in GGPP synthesis. In addition, this chapter highlight the importance of sample preparation to preserve the GGPP and limited its conversion to GGP (hydrolyzed product). This method is essential for further analysis in my thesis. Finally, in the fourth chapter of my thesis “An atypical kinase ABC1K1 allocates geranylgeranyl diphosphate to the carotenoid biosynthesis pathway in plastoglobules of chromoplasts”, I investigate the role of SlABC1K1 in tomato fruit carotenoid metabolism. The CRISPR-Cas9 mutant of SlABC1K1 (slabc1k1) showed the photosynthetic PGR6 phenotype in leaves that had previously been observed in Arabidopsis. Surprisingly, slabc1k1 fruit had an orange phenotype. The slabc1k1 phenotype was linked to reduced lycopene accumulation as well as that of its phytoene precursor. Based on our results, I propose two possible scenarios for the function of SlABC1K1 in tomato fruit plastoglobules. SlABC1K1 may acts as a key regulator for geranylgeranyl diphosphate (GGPP) allocation to the carotenoid pathway or as a co-regulator of carotenoid biosynthesis enzymes in plastoglobules. The discovery that SlABC1K1 is required for the GGPP allocation to plastoglobule is the principal result of my thesis.
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    How chloroplasts protect themselves from unfolded proteins
    (2019-10-15)
    Kessler, Félix 
    ;
    Longoni, Fiamma 
    A genetic screen has identified the first signaling component of the unfolded protein response in chloroplasts.
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    Plastoquinone homoeostasis by Arabidopsis proton gradient regulation 6 is essential for photosynthetic efficiency
    (2019-6-20)
    Pralon, Thibaut 
    ;
    Venkatasalam, Shanmugabalaji 
    ;
    Longoni, Fiamma 
    ;
    Ksas, Brigitte
    ;
    Collombat, Joy 
    ;
    Desmeules, Saskia
    ;
    Glauser, Gaëtan 
    ;
    Havaux, Michel
    ;
    Finazzi, Giovanni
    ;
    Kessler, Félix 
    Photosynthesis produces organic carbon via a light-driven electron flow from H2O to CO2 that passes through a pool of plastoquinone molecules. These molecules are either present in the photosynthetic thylakoid membranes, participating in photochemistry (photoactive pool), or stored (non-photoactive pool) in thylakoid-attached lipid droplets, the plastoglobules. The photoactive pool acts also as a signal of photosynthetic activity allowing the adaptation to changes in light condition. Here we show that, in Arabidopsis thaliana, proton gradient regulation 6 (PGR6), a predicted atypical kinase located at plastoglobules, is required for plastoquinone homoeostasis, i.e. to maintain the photoactive plastoquinone pool. In a pgr6 mutant, the photoactive pool is depleted and becomes limiting under high light, affecting short-term acclimation and photosynthetic efficiency. In the long term, pgr6 seedlings fail to adapt to high light and develop a conditional variegated leaf phenotype. Therefore, PGR6 activity, by regulating plastoquinone homoeostasis, is required to cope with high light.
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    The role of alpha-tocopherol in the protection of tomato plants against abiotic stress
    (2017)
    Spicher, Livia
    ;
    Kessler, Félix 
    La capacité de conversion de l’énergie par les chloroplastes en condition de stress et son aptitude à s’adapter à un environnement en constante évolution est cruciale pour la survie des plantes. Les réactions photosynthétiques se produisent au niveau des photosystèmes dans les thylakoïdes des chloroplastes. Les photosystèmes sont composés de protéines dans un environnement lipidique spécifique. Ce dernier comprend non seulement des lipides membranaires mais aussi des pigments lipophiles (chlorophylles, caroténoïdes) et des prénylquinones (plastoquinone, phylloquinone, tocophérol). À part leurs rôles de collecteur de lumière et leurs implications dans le transport d’électrons, les caroténoïdes et les prénylquinones (respectivement) ont d’importantes propriétés antioxydantes et protègent les cellules végétales contre les espèces réactives à l’oxygène. Le but de ce travail est de comprendre comment les plantes résistent et s’adaptent aux stress environnementaux, en particulier aux fortes intensités lumineuses, à la hausse de température et à la combinaison des deux. Le métabolisme des lipides prend place dans les sous-compartiments des plastides, au niveau des enveloppes, des membranes des thylacoïdes et de ses microdomaines, appelés plastoglobules. Les plastoglobules sont impliqués dans diverses voies métaboliques biosynthétiques essentielles et dans l’accumulation des molécules de prénylquinone. Dans cette thèse, nous avons utilisé la tomate comme système modèle afin d’étudier le rôle de la synthèse des (prényl) lipides ainsi que leur remodelage dans la protection de la fonction photosynthétique en condition de stress. Après une introduction sur l’implication des chloroplastes dans le métabolisme des lipides, nous avons résumé, dans le chapitre 2, les récents progrès de la recherche sur les plastoglobules et leurs implications sur la biosynthèse et le métabolisme de la vitamine E et de la vitamine K1. Ensuite, dans le chapitre 3, nous avons étudié comment le chloroplaste est protégé contre le stress dû à la hausse de la température. Parmi les centaines de composés qui changent sous stress thermique, nous avons identifié l’α-tocophérol et la plastoquinone comme étant les antioxydants les plus significativement en hausse. Cette découverte suggère un nouveau rôle pour ces deux prénylquinones dans la protection de l’appareil photosynthétique contre le stress thermique. Dans le chapitre 4, nous avons fourni des informations précieuses sur les flux métaboliques et de biosynthèse impliqués dans l’accumulation de la vitamine E chez la tomate. Enfin, au chapitre 5, nous avons cherché à identifier les molécules qui contribuent à la protection contre le stress dû à la hausse des températures combiné au stress de haute intensité lumineuse. Pour perturber les niveaux d’α-tocophérols, nous avons utilisé un mutant chez la tomate ayant perdu la fonction du VTE5 (vte5). Les données indiquent que le VTE5 protège la plante contre la hausse des températures combinée au stress de forte intensité lumineuse en soutenant la production d’α-tocophérol. D’une manière générale, cette thèse contribue à une meilleure compréhension du rôle des prénylquinones impliqués dans la résistance chez la tomate au stress de forte intensité lumineuse combiné à la hausse de température., The ability of energy conversion by the photosynthetic machinery under stress and its capacity to adjust to an ever-changing environment is crucial for plant survival. The photosynthetic light reactions occur at the photosystems in the thylakoids of chloroplasts. The photosystems are composed of proteins in a specific lipid environment. It includes not only membrane lipids but also lipophilic pigments (chlorophylls, carotenoids) and prenylquinones (plastoquinone, phylloquinone, tocopherol). Apart from their respective roles in light harvesting and electron transport, carotenoids and prenylquinones have important antioxidant properties and protect plant cells against reactive oxygen species. The focus of this work is to understand how plants resist and adapt to environmental stress in particular high light, high temperature and the combination of the two. Lipid metabolism takes places in plastid subcompartments, at the level of envelopes, at thylakoid microdomains called plastoglobules. Plastoglobules are involved in various essential biosynthetic metabolic pathways and accumulation of prenylquinone molecules. In this thesis, we use tomato as the model system to address the role of (prenyl) lipids synthesis and remodelling to protect photosynthetic function under stress. After an introduction on the implication of photosynthetic machinery in lipid metabolism, in Chapter 2 we summarized recent advances in plastoglobule research and their findings on biosynthesis and metabolism of Vitamins E and K1. Then in Chapter 3, we investigate the question of how the photosynthetic machinery is protected against heat stress. Amongst many hundreds of compounds that change under heat stress, we identified α-tocopherol and plastoquinone as the most significantly increased antioxidants. This finding suggests a new role for these two prenylquinones in protecting the photosynthetic apparatus against temperature stress. In Chapter 4, through a joint effort, we provided valuable information on the metabolic fluxes and biosynthesis of Vitamin E in tomato. Finally, in Chapter 5, we intended to identify molecules that contribute to the protection against combined high temperature and high light stress. To perturb α-tocopherol levels we used the tomato vte5 knock down-line. The data indicate that VTE5 protects against combined high light and high temperature stress and does so by supporting α-tocopherol production. Overall, this thesis contributes to a better understanding of the role of prenylquinone compounds, in the resistance of tomato plants against high light and high temperature stresses.
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    Chloroplast lipid droplet type II NAD(P)H oxidoreductase, NDC1, is essential for vitamin E and K1 metabolism
    (2017)
    Eugeni Piller, Lucia 
    ;
    Kessler, Félix 
    Les cellules végétales possèdent dans leurs différents tissus des organelles spécialisées appartenant à la famille des plastes. Le chloroplaste est le principal membre de cette famille et il est responsable de la photosynthèse dans les plantes. La majorité des plastes contiennent des particules lipoprotéiques ("gouttelettes lipidiques") appelées plastoglobules.
    Peu est connu au sujet des plastoglobules qui ont été pendant une longue période imaginés comme des gouttelettes de stockage passif. En effet, le cœur hydrophobe des plastoglobules chloroplastiques contiennent des lipides neutres comme les prénylquinones (plastoquinone, plastochromanol-8, phylloquinone, tocophérol), les caroténoïdes, les triacylglycérols, les phytyl esters et d'autres lipides inconnus.
    Les plastoglobules sont aussi composés de protéines et certaines d'entre-elles participent à des réactions métaboliques qui se déroulent dans les plastoglobules.
    Pendant mon doctorat, j’ai démontré que NDC1 (NADP(H) déshydrogénase C1 (At5g08740), prédite comme une NAD(P)H-dépendante réductase de quinones, est physiquement associé aux gouttelettes lipidiques des chloroplastes.
    Grâce à la génétique inverse et une approche in vitro il a été démontré que NDC1 contrôle l'état redox du réservoir de plastoquinone en injectant des électrons dans le plastoquinone à l’intérieur des plastoglobules. Cet effet sur l'état redox des plastoquinones facilitent l'accumulation du plastochromanol. Nous pouvons supposer que NDC1 puisse jouer un rôle en tant que réducteur des intermédiaires quinones qui précèdent la cyclisation par VTE1.
    De manière surprenante, NDC1 est requis pour la dernière étape de méthylation lors de la biosynthèse de la phylloquinone (Vitamine K1). En effet, les mutants ndc1 accumulent le précurseur non-méthylé, le 2-phythyl-1,4-naphtoquinone ce qui montre que NDC1 est une enzyme indispensable de cette voie de biosynthèse.
    L’ensemble des découvertes permettent d'affirmer que les plastoglobules ne sont pas un simple lieu de stockage de lipides mais ils possèdent un rôle dans les métabolismes biosynthétique et énergétique., Plant cells in different tissues contain specialized organelles belonging to the family of plastids. The chloroplast is the most prominent family member and responsible for photosynthesis in leaves. Most plastid types contain lipoprotein particles ("lipid droplets") termed plastoglobules. Little is known about plastoglobules that were long regarded as passive storage droplets. Indeed, the hydrophobic core of chloroplast plastoglobules contains neutral lipids such as the prenylquinones, carotenoids, triacylglycerols, phytyl esters and others unknown. Plastoquinone, plastochromanol-8, phylloquinone and tocopherol are prenylquinone molecules stored partly in the plastoglobule but functioning in the chloroplast thylakoids. Plastoglobules also carry proteins and some of these have been demonstrated to participate in metabolic reactions taking place at plastoglobules.
    During my PhD work I demonstrated that NDC1 (NAD(P)H dehydrogenase C1 (At5g08740)), a candidate plastoglobule protein and predicted NAD(P)H-dependent quinone reductase is physically associated with the lipid droplets. A combined reverse genetic and in vitro approach demonstrated that NDC1 controls the overall REDOX state of the total plastoquinone reservoir. NDC1 does so by reducing the plastoquinone reservoir of plastoglobules. These findings provided evidence that plastoglobules are not simply a lipid storage site but have a role in energy metabolism. Besides its effects on the plastoquinone REDOX state NDC1 also facilitates plastochromanol accumulation and, surprisingly, is required for the last methylation step in phylloquinone (Vitamin K1) biosynthesis. The ndc1 mutant accumulates the non-methylated precursor, the 2-phythyl-1,4-naphtoquinone but up to now we have been unable to determine the precise mechanism. In conclusion, I have shown that NDC1 is a unique electron input device affecting the REDOX state of the overall plastoquinone pool. But more than that NDC1 is a key player at the intersection of a variety of prenylquinone metabolic pathways. By mutant analysis, I identified that NDC1 is the second enzyme that is implicated in the tocopherol redox cycle. Presumably NDC1 plays a role as reducer of quinone intermediates foregoing the cyclization by VTE1. It has been also demonstrated that high light stress triggers far-ranging changes in prenylquinone composition studied in mutants and overexpressing lines of VTE1 and NDC1 enzymes. The discovery that NDC1 is a new component of phylloquinone biosynthesis pathway is the single most important result of my thesis.
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    The novel chloroplast outer membrane kinase KOC1 is a required component of the plastid protein import machinery
    (2017)
    Zufferey-Arias, Mónica Alexandra
    ;
    Kessler, Félix 
    Le chloroplaste est un organite essentiel de la cellule végétale, il est le siège de la photosynthèse. Un événement d’endosymbiose est à l’origine du chloroplaste : une cellule eucaryote primitive a ingéré une cyanobactérie photosynthétique. Pendant l’évolution, la majorité des gènes du chloroplaste primitif ont été transférés vers le noyau. Les protéines issues des gènes transférés avec succès, sont maintenant synthétisées par des ribosomes dans le cytosol et importées dans les chloroplastes. Les protéines destinées au chloroplaste (pré-protéines) acquièrent une séquence additionnelle clivable codant pour un peptide à l’extrémité N-terminal (séquence d’adressage). La séquence d’adressage est reconnue par la machinerie d’importation du chloroplaste qui initie le transport des pré-protéines. La machinerie d’importation consiste en un translocon situé dans la membrane externe/interne du chloroplaste (TOC/TIC) (Translocon at the Outer/Inner membrane of Chloroplast). L’importation de centaines de différentes protéines dépend des complexes TOC et TIC. Le noyau du complexe TOC est composé de trois protéines, les récepteurs GTPase Toc159 et Toc34 ainsi que le canal Toc75. Ensemble ils reconnaissent et transfèrent les pré-protéines à travers la membrane externe du chloroplaste. Toc34 et Toc159 qui sont exposés à la surface du chloroplaste, fonctionnent en tant que récepteurs et ont des domaines G (GTP-binding) homologues. En plus du domaine G, Toc159 possède le domaine A (acide) à l’extrémité N-terminal qui s’étend dans le cytosol et contrôle la spécificité du récepteur, et le domaine M à l’extrémité C-terminal qui ancre la protéine à la membrane. Toc75 appartient à la famille OMP85, protéines de la membrane externe des bactéries gram négatives. Dans les chloroplastes elles ont évolué pour fournir un canal de translocation de protéines à travers la membrane externe.
    Toc159 joue un rôle essentiel dans la biogenèse du chloroplaste. Les bases de données de phosphoprotéomique montrent que le domaine A de Toc159 est fortement phosphorylé. La protéine cytosolique caséine kinase II phosphoryle le domaine A in vitro. Toutefois d’autres kinases ayant la même fonction ont aussi été prédites. Tandis que la phosphorylation contrôle l’assemblage et l’activité des complexes d’importation de protéines dans les chloroplastes et les mitochondries, aucune kinase organite-spécifique n’a été identifiée jusqu’à présent. Par co-purification avec Toc159, nous avons découvert une protéine kinase dans la membrane externe du chloroplaste (KOC1 « Kinase at the Outer Chloroplast membrane 1 »). KOC1 est une protéine intégrale de membrane orientée vers le cytosol et associée de manière stable avec le complexe TOC. KOC1 phosphoryle le domaine A chez les membres de la famille Toc159 in vitro. Dans les chloroplastes des mutants koc1, l’efficience de l’importation des protéines a été réduite. Par ailleurs, les plantules koc1 ont un taux de survie réduit quand elles sont déplacées de l’obscurité à la lumière, quand une importation rapide des pré-protéines est nécessaire pour une biogenèse de chloroplastes complète. Nos résultats indiquent que KOC1 est un composant de la machinerie d’importation TOC en phosphorylant les récepteurs, en soutenant l’importation de pré-protéines et en contribuant à une biogenèse de chloroplastes efficiente., The chloroplast constitutes the site of photosynthesis and is an essential organelle in plant cells. An endosymbiotic event was at the origin of the chloroplast, an ancestral eukaryotic cell engulfing a photosynthetic cyanobacterium. During evolution, the majority of ancestral chloroplast genes were lost or transferred to the nucleus. The protein products of the successfully transferred genes are now synthesized by cytosolic ribosomes and imported into the chloroplast. The chloroplast destined proteins (preproteins) acquired an additional sequence that encodes a cleavable N-terminal targeting peptide (transit peptides). The transit peptide is recognized by the chloroplast import machinery, which initiates import. The import machinery consists of translocon complexes at the outer (TOC) and inner membrane of the chloroplast (TIC). The import of hundreds of different chloroplast proteins depends on TOC and TIC complexes. The TOC complex core contains three proteins, the GTPase receptors: Toc159, Toc34 and the channel Toc75, together they recognize and transfer the pre-proteins across the outer membrane of the chloroplast. Both Toc34 and Toc159 are exposed at the surface of the chloroplast, consistent with a receptor function, and have homologous GTP-binding domains (G-domain). In addition to the G-domain, Toc159 has a N-terminal A- (acidic) domain that extends into the cytosol and controls receptor specificity and a C-terminal membrane anchoring M-domain. Toc75 belongs to the OMP85 family that serves to integrate proteins into the outer membrane of gram negative bacteria, in chloroplasts it has evolved to provide a protein translocation channel across the outer membrane.
    Toc159 plays an essential role in chloroplast biogenesis. Phosphoproteomics databases show that Toc159 is highly phosphorylated at the A domain. Cytosolic casein kinase II phosphorylates the A-domain in vitro, however other A-domain kinases have been predicted.
    While phosphorylation controls assembly and activity of protein import complexes in both mitochondria and chloroplasts no organelle-specific kinases have been identified so far. By co-purification with Toc159, we discovered "Kinase at the Outer Chloroplast membrane 1" (KOC1). KOC1 is an integral membrane protein facing the cytosol and stably associating with TOC. KOC1 phosphorylated the A-domain of Toc159 family members in vitro. In mutant koc1 chloroplasts preprotein import efficiency was diminished. Moreover, koc1 seedlings had reduced survival rates when moved from the dark to the light when protein import is required to rapidly complete chloroplast biogenesis. Our data indicate that KOC1 is a functional component of the TOC machinery phosphorylating import receptors, supporting preprotein import and contributing to efficient chloroplast biogenesis.
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    Investigations of candidate plastoglobule proteins: characterization of chloroplast NON-INTRINSIC ABC PROTEINS 13 and -14 in "Arabidopsis thaliana" & Constitutive expression of CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 4 leads to a reduced level of photosynthesis-related carotenoids during senescence
    (2016)
    Rottet, Sarah
    ;
    Kessler, Félix 
    La photosynthèse est le processus clé se déroulant au sein du chloroplaste. La machinerie photosynthétique est intégrée à une matrice très dynamique, la membrane des thylakoïdes. Les galactolipides, les principaux lipides polaires de cette membrane, lui confèrent la propriété de bicouche alors que les lipides neutres tels que les prényllipides et les caroténoïdes contribuent à d’essentielles fonctions telles que le transport d’électrons et la photoprotection. Malgré de nombreuses études, la biogénèse et la dynamique des thylakoïdes restent irrésolus. Les plastoglobules (PG), des gouttelettes lipidiques associées aux thylakoïdes, participent activement aux fonctions des thylakoïdes. Sous un environnement changeant et lors des différents stades de développement, le recrutement d’enzymes spécifiques permet aux PG de participer à la synthèse, la réparation et l’élimination des métabolites. Dans le premier chapitre de cette thèse, nous passons en revue les PG en tant que microdomaines des thylakoïdes et discutons leur implication dans le remodelage lipidique lors de stress et lors de la conversion d’un type de plaste à l’autre.
    Le chapitre II est dédié à la caractérisation de NAP13 (ABCI10) et -14 (ABCI11). Ces deux protéines appartiennent à la grande famille des ABC. Chaque membre de la sous-famille ABCI présente un seul des domaines typiques des transporteurs ABC. NAP13 et -14 codent deux domaines prédits pour la liaison des nucléotides. En se basant sur de précédents résultats (Shimoni-Shor et al. 2010), notre première hypothèse impliquait NAP14, éventuellement avec NAP13, dans un transport de lipides entre les PG et les thylakoïdes. Cependant, cette thèse démontre que NAP13 est extrinsèquement associée à l’enveloppe interne du chloroplaste, alors que NAP14 cofractionne avec les thylakoïdes. Les mutants nap13 et -14 ont un phénotype albinos, ce qui souligne une fonction essentielle au sein du chloroplaste. Notons que nap13 et -14 ont un profile lipidique similaire, bien que distinct de trois autres mutants albinos. L’observation la plus pertinente étant leur taux réduit de phosphatidyléthanolamine 16:0/18:3. Les similarités partagées par nap13 et -14 suggèrent que les protéines correspondantes contribuent à la même voie métabolique. D’après nos résultats, il s’agirait d’un transport de lipides au niveau de l’enveloppe.
    Dans le chapitre III, nous décrivons la caractérisation de CCD4, une enzyme qui clive les caroténoïdes, et son association physique et fonctionnelle avec les PG. La fusion d’une protéine fluorescente avec CCD4 a donné lieu à un signal ponctué dans les chloroplastes typique d’une localisation aux PG in vivo. Pour élucider la fonction de CCD4, une étude de lipidomique comparative de mutants ccd4 et de plantes sauvages a été effectuée sous diverses conditions. Les résultats indiquent que CCD4 est impliquée dans la dégradation du β-carotène et de la lutéine lors de la sénescence des feuilles. Pour approfondir, nous avons conçu des lignées de surexpresseurs 35S:CCD4-YFP. En conclusion, nos résultats indiquent que le β-carotène, la lutéine et la violaxanthine sont les principaux substrats de CCD4 in vivo durant la différenciation du chloroplaste en gérontoplaste., Photosynthesis is the key bioenergetic process taking place in the chloroplast. The components of the photosynthetic machinery are embedded in a highly dynamic matrix, the thylakoid membrane. The galactolipids are the major polar lipid components of the thylakoid membrane conferring bilayer properties, while neutral thylakoid lipids such as the prenyllipids and carotenoids contribute to essential functions such as electron transport and photoprotection. Despite a large number of studies, the intriguing processes of thylakoid membrane biogenesis and dynamics remain unsolved. Plastoglobules, thylakoid-associated lipid droplets, appear to actively participate in thylakoid function from biogenesis to senescence. Recruitment of specific proteins enables the plastoglobules to act in metabolite synthesis, repair and disposal under changing environmental conditions and developmental stages. In the first chapter of this thesis, we review plastoglobules as thylakoid membrane microdomains and discuss their involvement in lipid remodeling during stress and in the conversion from one plastid type to another.
    The second chapter is dedicated to the characterization of NAP13 (ABCI10) and -14 (ABCI11). These two proteins belong to the large ABC family. Each member of the ABCI subfamily consists of only one of the typical domains of a full ABC transporter. NAP13 and -14 encode two predicted nucleotide-binding domains. Based on earlier results (Shimoni-Shor et al. 2010), our first hypothesis was that NAP14, possibly together with NAP13, are involved in lipid translocation between PG and thylakoids. However, this thesis demonstrates that NAP13 is extrinsically associated with the chloroplast inner envelope while NAP14 cofractionated with the thylakoid membrane. Both the nap13 and -14 mutants had albino phenotypes, emphasizing essential functions in the chloroplast. Interestingly, nap13 and -14 showed similar lipid profiles but distinct from three unrelated albino mutants. The most relevant observation was their reduced level of phosphatidylethanolamine 16:0/18:3. The striking similarities shared by nap13 and -14 suggest that they contribute to the same functional pathway. We hypothesize that this may be lipid transport at the envelope rather than between PG and thylakoids.
    In the third chapter, we describe the characterization of CCD4, a carotenoid cleavage dioxygenase, and its physical and functional association with PG. Fluorescence-tagged CCD4 resulted in a punctate pattern inside chloroplasts typical for PG localization in vivo. To discover the function of CCD4, a comparative lipidomics study of Arabidopsis ccd4 mutants and wild type was carried out under various conditions (light stress, senescence, Pseudomonas syringae infection). The results indicated that CCD4 is implicated in β-carotene and lutein degradation during leaf senescence. To further investigate the function of the enzyme, we engineered 35S:CCD4-YFP overexpressing lines. In conclusion, our findings indicate that β-carotene, lutein and violaxanthin are the principle substrates of CCD4 in vivo during chloroplast to gerontoplast differentiation.
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    Identification and characterization of putative Toc159 interacting partners
    (2015)
    Montandon, Cyrille
    ;
    Kessler, Félix 
    Le chloroplaste est l’organelle qui caractérise les plantes terrestres ainsi que les autres eucaryotes photosynthétiques. Il remplit diverses fonctions métaboliques, mais la photosynthèse est son activité principale, sa structure et sa composition protéique en témoignent. Le chloroplaste est le résultat d’une endosymbiose entre un eucaryote ancestral et une cyanobactérie photosynthétique. Le génome du chloroplaste, vestige de son ancienne autonomie, encode environ une centaine de protéines. Les 2000-3000 autres protéines présentes dans le chloroplaste sont codées dans le noyau et traduites dans le cytosol et doivent donc être importées dans le chloroplaste. Le « transit peptide » (peptide de transit), une courte séquence à la terminaison aminée des protéines destinées au chloroplaste, est suffisant et nécessaire pour l’import spécifique dans le chloroplaste. La voie Toc/Tic (Translocon at the Outer/Inner membrane of the chloroplast envelope: « Translocon à la membrane externe/interne de l’enveloppe du chloroplaste ») reconnait et import ces protéines en présence d’ATP et de GTP. Le noyau du complexe Toc est composé de Toc159 et Toc34/33, 2 récepteurs possédant un domaine GTPase, et de Toc75 qui constitue le pore du complexe. Toc159 est formé de 3 domaines, un domaine ancrant la protéine dans la membrane à l’extrémité carboxyle (domaine M), un domaine GTPase (domaine G) et un domaine acide (domaine A). Le taux d’import des protéines et sa spécificité envers les protéines clientes varient en fonction du développement de la plante, du tissu ou du type de plaste. Les différents homologues de Toc159 et de Toc34/33 chez A. thaliana forment des complexes distincts. Ils montrent une spécificité d’import différente et leur expression varie en fonction du stade de développement ou de la partie de la plante. Le domaine A de Toc159 et de ses homologues détermine partiellement la spécificité envers les différents types de protéines clientes. Le domaine A est hyper-phosphorylé et existe sous une forme soluble, certainement le résultat d’un clivage spécifique. Ces modifications post-traductionnelles pourraient influencer la spécificité de Toc159 envers les protéines clientes. Le contrôle de l’activité GTPase de Toc159 ou de Toc34/33 pourrait également influencer l’activité d’import. Le but de ce travail de thèse était la caractérisation de protéines co-précipitées avec une version taguée de Toc159 et identifiées par spectrométrie de masse, qui pourraient être potentiellement responsable des modifications mentionnées ci-dessus. L’effort principal a été fait sur Emb2004/AT1G10510, une protéine LRR (Leucine Rich Repeat) et des contributions ont été faites à la caractérisation d’une protéine kinase potentielle/AT4G32250 et de Tic56/AT5G01590., The chloroplast is the distinctive organelle of land plants and other photosynthetic eukaryotes. It carries out a variety of metabolic process, but photosynthesis is its main task and this is reflected in its structures and protein composition. Chloroplasts evolved from an endosymbiosis between a photosynthetic cyanobacterium and an ancestral eukaryote. Reminiscent of this autonomous origin, the chloroplast genome encodes approximately 100 proteins. The majority of the remaining 2000-3000 proteins identified in the chloroplast are encoded in the nucleus and translated in the cytosol and must be imported into the chloroplast. The transit peptide, a small sequence at the N-terminus of the proteins destined for the chloroplast, is necessary and sufficient for specific import into the chloroplast. The Toc/Tic (Translocon at the Outer/Inner membrane of the chloroplast envelope) pathway mediates the recognition and the translocation of these proteins in an ATP- and GTP-dependent way. The Toc core complex is constituted of two receptors with a GTPase domain, Toc159 and Toc34/33, and a channel, Toc75. Toc159 is formed of three domains, a C-terminal membrane anchoring domain (M domain), a GTPase domain (G domain) and an acidic domain (A-domain). The protein import rate and specificity toward client proteins vary depending on the developmental stage, tissue or plastid type. The different A. thaliana homologues of Toc159 and Toc34/33 form distinct complexes. They have different import specificities and their expression level depends on the developmental stage and the anatomical part of the plant. The A-domain of Toc159 and its homologues partially determine the specificity toward the different types of client proteins. The A-domain is hyper-phosphorylated and exists as a soluble form, likely the result of a specific cleavage. These post-translational modifications of the A-domain might play a role in determining the affinity of Toc159 toward client proteins. The control of the GTPase activity of Toc159 or Toc34/33 might also have an influence on the import. The aim of this thesis was the characterization of proteins potentially responsible for these modifications and that were co-purified with a tagged Toc159 and identified by mass-spectrometry. The main effort was made on Emb2004/AT1G10510, a LRR (Leucine Rich Repeat) protein and contributions were made for the characterization of a predicted protein kinase (AT4G32250) and Tic56 (AT5G01590).
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    Discovering the functions of the acidic domain of Toc159
    (2014)
    Munusamy Lakshmanan, Ashok
    ;
    Kessler, Félix 
    Preprotein  import  from  the  cytosol  is  a  key  mechanism  in  chloroplast  biogenesis.  Hundreds of different preproteins take an import route involving the chloroplast surface  receptor  Toc159.  Toc159  has  three  domains  A  (acidic),  G  (GTPase)  and  M  (membrane insertion). The N-­‐terminal, cytosolic A-­‐domain has been shown to contribute to preprotein specificity of Toc159 (Toc159A). This thesis began with specific questions to address the existence of hyperphosphorylated and soluble Toc159A as a separate  protein  in  the  cytosol  and  aims  at  expanding  our  understanding  of  Toc159-­‐dependent chloroplast protein import.
    In its first part, this thesis demonstrates the dual localization of Toc159A both in the cytosol and at the chloroplast envelope using TAP (tandem affinity purification)-­‐tagged Toc159A and Toc159A-­‐YFP (yellow fluorescent protein). Blue native polyacrylamide gel electrophoresis BN-­‐PAGE in combination with Western blotting identified Toc159A-­‐TAP complexes. However, the weak stability of the complexes required stabilization of the complexes by chemical crosslinking by formaldehyde prior to purification. Complexes identified by BN-­‐PAGE were confirmed by formaldeyhde crosslinking. Complexes were affinity purified and analysed by mass spectrometry. We identified putative interacting proteins  that  could  be  classified  into  three  main  categories.  1)  Chloroplast  targeted  Toc159-­‐dependent preproteins 2) two kinases predicted to be located at the chloroplast  envelope  and  in  the  cytoplasm,  3)  cytosolically  localized  Hsp70  and  Calmodulin. Upon confirmation, all of these offer exciting future research perspectives.
    The second part of the thesis focuses on in vitro experiments to understand possible roles  of  Toc159A  in  chloroplast  protein  import  and  Toc159A  phosphorylation.  Two  hypotheses were tested:
    1) First hypothesis: direct binding of the pSSU (pre-­‐small subunit of Rubisco) preprotein to  Toc159A  prior  to  import  into  the  organelle.  This  hypothesis  was  tested  by  adding  recombinant A-­‐domain to in vitro import assays. Inhibition of import at the earliest stages suggested an effect on the kinetics of import.
    2) Second  hypothesis:  regulation  of  ribosomal  translational  activity  by  the  A-­‐domain. This  hypothesis  was  tested  by  adding  phosphorylatable  or  non-­‐phosphorylatable  A-­‐domain to in vitro translation reactions. Phosphorylatable Toc159A had a positive effect  on  the  in  vitro  translation  of  an  early  developmental  stage  specific  preprotein  pSSU but negatively affected the late developmental stage specific preprotein pTic40. This suggests that Toc159 may directly affect the synthesis of preproteins that take an import route required early in development. While these results are in need of further experimentation, they suggest a novel mechanism for coupling preprotein translation to chloroplast protein import.