UNIVERSITE DE NEUCHATEL INSTITUT DE ZOOLOGIE Contribution à la connaissance de la reproduction chez la TIQUE Qrnithodoros moubata, Murray, 1877; sensu Walton, 1962 ( Ixodoidea : Argasidae ). THESE présentée à la Faculté des Sciences de l'Université de Neuchàtel pour l'obtention du grade de docteur es sciences par Jacques DUCOMMUN Travail réalisé avec l'appui du Fonds national suisse de la Recherche scientifique -1984- IMPRIMATUR POUR LA THESE Contribution à la connaissance de la repro- duction chez la Tique Ornithoâoros moubata, Murray, 1877 sensu Walton, 1962 (Ixodoidea: Argasidae) de M onsieur Jacques Ducommun UNIVERSITÉ DE NEUCHATEL FACULTE DES SCIENCES La Faculté des sciences de l'Université de Neuchàtel, sur le rapport des membres du jury, Messieurs P.A. Diehl, A. Aeschlimann, J.-L. Connat et H. Huggel (Genève) autorise l'impression de la présente thèse. Neuchàtel. Ie 6 août 1984 Le doyen; H. Beck TABLE DES MATIERES Page 1. INTRODUCTION 1 2. MATERIEL ET METHODES g 2.1. Matériel d'étude, élevage 8 2.1.1. Obtention de femelles nourries et 9 ayant copule 2.1.2. Obtention de femelles vierges nourries 9 2.1.3. Obtention de femelles ayant copule 9 tardivement 2.1.4. Obtention de femelles ayant copule à 9 jeun 2.2. Stimulation chimique de la ponte 10 2.2.1. Injections 10 2.2.2. Préparation de la substance active 10 contenue dans le spermiophore des mâles 2.2.3. Détermination du poids moléculaire 10 2.2.4. Préparation des broyats de testicules, 11 glandes annexes et vésicules séminales 2.2.5. Digestion enzymatique 12 2.3. Stimulation mécanique de la ponte 14 2.3.1. Stimulation par introduction de billes 14 d'acier dans le vagin 2.3.2. Contrôle des résultats 14 2.4. Broyats et transplantations de "cerveaux" 14 2.4.1. Injection des broyats de "cerveaux" 14 2.4.2. Transplantations de "cerveaux" 15 2.4.3. Contrôle des résultats 15 2.5. Traitements aux hormones juvéniles 17 2.6. Traitements aux "Precocene" 18 2.7. Vitellogénines et vitellines 18 2.7.1. Extraction et purification partielle 18 des protéines solubles de l'oeuf 2.7.1.1. Extraction 19 2.7.1.2. Précipitation au sulfate 19 d'ammonium 2.7.1.3. Filtration sur gel 20 2.7.1.4. Colonne échangeuse d'ions 20 2.7.1.5. Récolte de 1'hémolymphe 20 2.7.2. Electrophorèse sur Polyacrylamide 22 2.7.3. Electrophorèse SDS sur Polyacrylamide 22 2.7.4. Electrofocalisation 23 2.7.5. Techniques immunologiques 23 2.7.5.1. Obtention d'anticorps 23 2.7.5.2. Microimmunodiffusions 23 2.7.5.3. Immunoélectrophorèses 24 2.8. Tests statistiques 24 RESULTATS 25 3.1. Copulation, vitellogénèse et ponte: mesure 25 de quelques paramètres de notre élevage 3.1.1. Variation du poids des femelles de 25 notre élevage 3.1.2. Corrélation entre le poids gorgé et 31 le poids à jeun des femelles 3.1.3. Corrélation entre le poids de sang 31 ingéré et le nombre d'oeufs pondus 3.1.4. Corrélation entre le nombre d'oeufs 35 pondus et le poids de femelles nourries depuis 100 jours 3.1.5. Poids d'un oeuf 35 3.1.6. Poids des ovaires secs 38 3.2. Action de la copulation sur la vitellogénèse 40 et la ponte : facteur chimique du mâle 3.2.1. Détermination du poids moléculaire 40 de la "substance active" du mâle 3.2.2. Injections de broyats de testicules, glandes annexes et vésicules séminales 49 Page 3.2.2.1. Glandes annexes et 49 testicules 3.2.2.2. Vésicules séminales 49 3.2.3. Femelles nourries une deuxième fois 53 après stimulation chimique de la vitellogénèse et de la ponte 3.2.4. Digestion de la substance active par 54 la trypsine 3.3. Action de la copulation sur la vitellogénèse 55 et la ponte : stimulation mécanique 3.3.1. Stimulation mécanique par implanta- 55 tion de billes métalliques dans l'utérus 3.3.2. Synergie entre stimulation mécanique 57 et chimique 3.3.3. Durée de la préoviposition 61 3.4. Effets gonadotropes liés à l'implantation de 61 "cerveaux" 3.4.1. Broyats de "cerveaux" 61 3.4.2. Transplantations de "cerveaux" 61 3.4.2.1. Donneuses nourries depuis 62 2 jours et ayant copule 3.4.2.2. Donneuses dans différents 63 états physiologiques 3.4.2.3. Transplantation de "cerveaux" 65 avec ou sans complexe endocrine rétrocérébral 3.5. Action des hormones juvéniles sur la 67 vitellogénèse et la ponte 3.5.1. Injection et application externe: 67 comparaison des méthodes 3.5.2. Détermination de la dose optimale 70 effective en injection 3.5.3. Distinction entre stimulus de JH-I 71 et stimulus de JH-III 3.5.4. Injection d'isomères naturels de 78 JH-I1 JH-II et JH-III 3.6, Action des "Precocene" sur la vitellogénèse 80 et la ponte 3.7, Vitellogénines et vitellines: purifications 83 partielles et comparaisons 3.7.1. Disc-électrophorèse sur polyacryla- 83 mi de 3.7.2. Purification des protéines majeures 87 de 1'oeuf 3.7.3. Etude de quelques caractères physico- 91 chimiques de la fraction protéique OP2 3.7.3.1. Détermination du poids 91 moléculaire 3.7.3.2. Electrophorèse de OP2 91 lyophilisé 3.7.3.3. Comparaison des électropho- 92 régrammes de OP2 lyophilisé, d'hémolymphe de femelles et de broyats d'oeufs 3.7.3.4. Détermination du pH isoé- 93 lectrique de OP2 3.7.3.5. Spectre d'absorption de OP2 93 3.7.4. Etude des fractions protéiques de 93 1'hémolymphe 3.7.4.1. Purification de HL3 et HL4 93 3.7.4.2. Spectre d'absorption de 97 HL3 et HL, purifiées 3.7.5. Tests immunologiques 97 3.7.5.1. Tests d'Ouchterlony 97 3.7.5.2. Immunoélectrophorèses 99 3.7.6. Disc-électrophorèse en SDS de 101 différentes protéines purifiées DISCUSSION 106 4.1. Paramètres de 1'élevage 106 4.2. Stimulation de la vitellogénèse au moyen 107 d'un facteur chimique produit par le mâle 4.3. Stimulation de la vitellosénèse par 111 l'action mécanique de la copulation Page 4.4. Stimulation de la vitellogénèse par 112 l'implantation de "cerveaux" 4.5. Stimulation de la vitellosénèse par un 114 apport exogène d'hormones juvéniles. Etude des effets inhibiteurs des "Precocene 1 et 4.6. Vitellogénines et vitellines 117 5. RESUME DES RESULTATS OBTENUS ET HYPOTHESES 123 REMERCIEMENTS 126 BIBLIOGRAPHIE 128 1. INTRODUCTION Les tiques (Chelicerata. Acari) forment une super-famille, les Ixodoidea. Leur adaptation à un strict régime hématophage est remarquable (rostre conformé en une sorte de stylet pour percer les téguments, présence de diverticules intestinaux permettant l'ingestion d'une grande quantité de sang, systèmes d'osmoregulation originaux, etc...). Leur cycle biologique les oblige à des contacts réguliers avec des hôtes vertébrés (HOOGSTRAAL & AESCHLIMANN, 1982). En effet, chaque rencontre permet la prise d'un repas sanguin, nécessaire à deux processus vitaux pour !'ectoparasite i la mue et la ponte. Les tiques sont d'importants vecteurs d'agents pathogènes. Le lecteur trouvera les renseignements les plus complets à ce sujet dans les ouvrages généraux de ARTHUR (1962), BALASHOV (1972) et HOOGSTRAAL (1978). Rappelons que la transmission se fait par divers mécanismes : via les glandes salivaires pour la majorité des microorganismes, par l'organe coxal chez les Argasides, par transmission stercorale pour certaines rickettsies, par effraction à la hauteur des pièces buccales pour les microfi- laires et peut-être par régurgitation pour certains spirochetes (AESCHLIMANN, 1976j BURGDORFER & al, 1983). Une autre particularité repose sur le fait que plusieurs agents pathogènes sont transmis via les oeufs à la génération suivante, rendant les descendants d'emblée infectieux. Par conséquent, l'étude de l'ovogénèse chez les tiques prend une importance d'autant plus grande qu'elle implique une incidence épidémio- logique. Pour des raisons traditionnelles de continuité dans l'étude d'un même modèle et pour des facilités techniques, nous avons choisi Ornithodoros moubata comme matériel de recherches. Le domaine dans lequel nous avons travaillé est encore relative- ment peu étudié chez les tiques. Il nous a donc paru nécessaire d'énumérer tout d'abord quelques généralités concernant les 1 insectes, chez qui les phénomènes liés à la reproduction sont beaucoup mieux connus. Chez les insectes, la copulation permet ou stimule souvent divers processus tels que fécondation, intensité de la vitellogénèse, ovulation et ponte (revue de ENGELMANN, 1970). La nature du stimulus primaire du mâle, relativement bien com- prise chez quelques espèces, peut être mécanique, chimique ou les deux à la fois (ENGELMANN, 1959, I960; ROTH & STAY, 1961 s DAVEY, 1965; BOULETREAU-MERLE, 1975). La composition des substances actives produites par le mâle n'est élucidée que chez peu d'espèces, pour l'instant. Ces substances, de nature proti- dique, sont transmises à la femelle par le liquide paragonial. Il s'agit soit de peptides, chez Drosophila melanogaster (BURCKHARDT, 1975), soit de dérivés d'acides aminés, chez Drosophila funebris (BAUMANN, 1974), soit encore de protéines, chez Aedes aegypti (FUCHS & HISS, 1970). Le cerveau de la femelle joue souvent le rôle de relais et active la vitellogénèse et la ponte par des neurosécrétions (revues de ENGELMANN, 1970; DOANE, 1973; HIGHNAM & HILL, 1977). Les corpora aliata, activés dans certains cas par des neurosécré- tions, forment un deuxième organe-relais en produisant des hor- mones juvéniles qui peuvent stimuler la synthèse de protéines particulières (vitellogénines) par le corps gras ou préparer l'ovaire à incorporer ces protéines dans les ovocytes en ménageant des espaces entre les cellules folliculaires (revue de HIGHNAM & HILL, 1977). On connaît actuellement quatre hormones juvéniles naturelles chez les insectes i JH-O, JH-I, JH-II et JH-III, avec respectivement 19, 18, 17 et 16 atomes de carbone incorporés dans la molécule (ROELLER & al, 1967; BERGOT & al, 1980). Des substances analogues peuvent mimer les effets de ces hormones chez les in- sectes (revue de SLAMA & al, 1974). En 1976, BOWERS & al ont extrait d'une plante composée deux produits inhibant la biosynthèse d'hormone juvénile au niveau des corpora aliata. Ces deux substances, nommées "Precocene 1" et "Precocene 2", se sont révélées actives chez plusieurs 2 espèces d'insectes (PRATT & BOWERS, 1977- PENER & al, 1978; BROOKS Sc al, 1979; PRATT & al, 1980; LANDERS & HAPP, 1980). Les protéines constituant le vitellus de l'oeuf chez les insectes sont nommées vitellines. Elles dérivent de précurseurs (vitellogénines) synthétisés principalement par le corps gras (revue de HAGEDORN & KUNKEL, 1979). Ces substances sont essen- tiellement des glycolipoprotéines de haut poids moléculaire. Chez les tiques, il faut considérer séparément la famille des Ixodides et celle des Argasides, car leurs représentants ont une biologie relativement différente, notamment en ce qui con- cerne la reproduction (revues d'AESCHLIMANN & GRANDJEAN, 1973 a; OLIVER, 1974). Toutefois, en règle générale, la femelle a besoin et d'un repas sanguin et d'une copulation pour être en mesure de pondre ses oeufs et d'assurer ainsi sa descendance. Chez les Ixodides, genre Ixodes excepté, la copulation a lieu sur l'hôte pendant le repas sanguin. Elle permet à la femelle de se gorger complètement et d'accomplir sa vitellogénèse. Les femelles d'Ixodides ne pondent qu'une seule fois un grand nombre d'oeufs (jusqu'à 20'00O) et meurent ensuite (ARTHUR, 1962). Si la femelle reste vierge, elle continue pendant un certain temps à prélever de faibles quantités de sang sur son hôte, puis se détache et meurt sans avoir pondu (PAPPAS & OLIVER, 1971, 1972; BALASHOV, 1972; GRAF, 1978). Contrairement à la plupart des Ixodides, les femelles d'Argasi- des n'ont pas besoin de copuler pour se nourrir. La copulation n'a donc aucun rôle sur la prise du repas de sang, mais influ- ence la digestion, la vitellogénèse et la ponte. Chez Ornitho- doros moubata. les femelles vierges, lorsqu'elles ont été nourries sur cobaye, commencent une vitellogénèse ralentie par rapport aux femelles témoins ayant copule. Après 20 à 30 jours, les ovocytes se mettent à résorber leur vitellus qui aura com- plètement disparu trois à quatre semaines plus tard. Après une longue période de préoviposition, moins de 15 % des femelles pondent; les oeufs, en faibles quantités, sont généralement non viables (AESCHLIMANN, 1968; GERMOND & AESCHLIMANN, 1977). 3 Par ce processus, la plupart des femelles vierges conservent la majeure partie de leur repas sanguin non digéré, stocké dans l'intestin. Après plusieurs mois, la copulation leur permet de reprendre la digestion du gâteau sanguin et de recommencer un nouveau cycle de vitellogénèse. Celui-ci conduit à la ponte après une période normale de préoviposition de 10 à 15 jours (AESCHLIMANN, 1968). Les femelles des tiques ont donc développé un mécanisme com- plexe permettant l'utilisation du repas sanguin dans le seul cas où celle-ci conduit à une ponto viable. Chez les Ixodides, la copulation règle directement la prise du repas sanguin, alors que chez les Argasides, elle permet la digestion complète de ce repas. De nombreux travaux tant sur les Ixodides que les Argasides ont été effectués pour tenter de comprendre les mécanismes physiologiques par lesquels la copulation agit sur la femelle. Le rôle de la stimulation mécanique de l'appareil génital chez la femelle lors de la copulation a été étudié en introduisant des matériaux étrangers (et inertes) dans le vagin de sujets vierges. Dans le cas des Ixodides, la seule stimulation mécanique ne semble pas capable d'induire la phase rapide de gorgement, chez Amblyomma americanum. Par conséquent, la vitellogénèse et la ponte n'ont pas lieu (OLIVER & al, 1975). En ce qui concerne les Argasides, la distension du vagin ou de l'utérus n'a aucun effet gonadotrope chez les femelles d'Orni- thodoros tholozani ou d'Argas arboreus (GALUN & WARBURG, 1967; KHALIL & SHANBAKY, 1975), alors qu'une faible stimulation de la vitellogénèse est observée chez A. persicus (LEAHY & GALUN, 1972). L'utilisation de mâles stériles ou de mâles d'une autre espèce a permis aux auteurs de connaître l'aspect non fécondant de la copulation. Les spermatophores ou les spermiophores non fécon- dants sont en effet capables d'induire la vitellogénèse et la ponte chez les Ixodides étudiés : Dermacentor variabilis (PAPPAS & OLIVER, 1972), A. hebraeum (SPICKETT, 1978). Chez les Argasides, 4 les effets rencontrés sont très variés selon les espèces. En ce qui concerne A. persicus et 0. tholozani. ce stimulus conduit à une vitellogénèse normale (GALUN & WARBURG, 1967; LEAHY & GALUN, 1972). A l'opposé, aucun effet gonadotrope n'est observé chez A. arboreus (KHALIL & SHANBAKY, 1975). Bien que l'intensité de la stimulation gonadotrope provoquée par l'introduction d'un spermatophore dans le vagin de femelles soit variable, il semble que ce stimulus puisse jouer un rôle dans le contrôle de la reproduction des tiques. L'analyse de ce phénomène a été menée plus finement en injectant, dans le vagin et l'utérus de femelles, des homogénats de diverses glandes du mâle participant à la formation du spermatophore ou encore de certaines substances trouvées dans celui-ci. Chez l'Ixodide A. americanum. l'injection d'homogénats de glandes accessoires ne présente aucun effet (OLIVER & al, 1975), alors que chez les Argasides, la vitellogénèse peut être fortement stimulée, voire même la ponte obtenue. L'injection d'extraits de testicules ou de surnageants de spermiophores ont le même effet (GALUN & WARBURG, 1967j AESCHLIMANN, 1968; KHALIL & SHANBAKY, 1975; GERMOND & AESCHLIMANN, 1977). Ces travaux montrent donc l'importance des différentes sécrétions contenues dans les spermiophores pour le bon déroulement de la vitellogénèse. La copulation, par l'ensemble des stimuli mécaniques et humoraux qu'elle comporte, constitue donc un élément nécessaire à l'in- duction de la vitellogénèse et de la ponte chez les tiques. La manière dont la femelle perçoit ces stimuli représente un des problèmes essentiels de la physiologie de la reproduction. Certains travaux laissent penser que le "cerveau" pourrait être un organe-cible pour ces stimulations. Des cellules neurosécré- trices ont été décrites dans le "cerveau", tant chez les Ixodides que chez les Argasides (revue de BINNINGTON & OBEN- CHAIN, 1980) et il a été possible, dans quelques cas, de mettre en relation leur activité de synthèse avec des événements physiologiques : prise du repas sanguin, vitellogénèse, ponte 5 (Hyalomma dromedari! i DHANDA, 1967; 0. moubata i EICHENBERGER, 1970, A. perslcus : Eisen & al, 1973; 0. tholozani t GABBAY & WARBURG, 1976), D'autres structures neurosécrétrlces ont été décrites; l'organe rétrocérébral situé à la jonction oesophage - intestin (ROSHDY & al, 1973; OBENCHAIN & OLIVER, 1975) et les organes latéraux, situés de part et d'autre du "cerveau" (BINNINGTON, 1981), ont une structure très analogue à celle du complexe corpora cardiaca-corpora aliata des insectes. L'injection de broyats de "cerveaux" est capable de provoquer la ponte chez des femelles vierges (AESCHLIMANN, 1968; SHANBAKY & KHALIL, 1975) mais on ne connaît pas, actuellement, la nature du principe actif de ces broyats. De nombreux travaux, utilisant les hormones juvéniles ou les analogues d'hormones juvéniles, ont montré une action de ces substances sur la vitellogénèse (voir revues de DIEHL & al, 1982, SOLOMON & al, 1982); ces résultats ont amené certains auteurs à utiliser des substances ayant des effets anti-alla- totropes chez les insectes •• les "Precocene". Pour la plupart des espèces, des résultats assez peu nets et parfois contra- dictoires ont été obtenus. Un effet clair d'inhibition complète de la vitellogénèse ainsi que la possibilité de sa restauration par injection de JH-III, n'a été montré que chez 0. parkeri (POUND & OLIVER, 1979). Le contrôle endocrine de la vitellogénèse et de la ponte des tiques est donc très mal connu. Les hormones mises en jeu ne sont pas encore isolées et identifiées comme elles le sont chez les insectes. A la lumière de toutes les connaissances acquises dans notre laboratoire sur la vitellogénèse et la ponte d'O. moubata. nous avons tenté, dans ce travail, de mieux cerner les mécanismes physiologiques présidant au bon déroulement de ces processus dans notre modèle. Le rôle de la copulation en tant que stimulation mécanique et chimique a été étudié, ainsi que le rôle possible du syngan- glion ("cerveau") en tant qu'organe neurosécréteur. Les hormones juvéniles et les "Precocene" ont également été utilisés afin de 6 savoir s'il existe une analogie dans le contrôle de la vitellogénèse chez les tiques et chez les insectes. Une dernière partie de ce travail a consisté à étudier les protéines vitellines, sur lesquelles les connaissances sont encore fragmentaires. Nous nous sommes particulièrement intéressés aux changements des caractères physico-chimiques de ces protéines avant et après leur incorporation dans les ovocytes . 7 2. MATERIEL ET METHODES 2.1. MATERIEL D'ETUDE, ELEVAGE Ornlthodoros moubata (MURRAY, 1877, sensu WALTON, 1962), de la famille des Areasldae. vit à l'état sauvage dans certaines régions d'Afrique equatoriale. Cette tique est le vecteur d'un spirochéte, Borrelia duttoni. responsable de fièvres récurren- tes de l'homme (BURGDORFER, 195li GEIGY & MOOSER, 1955; AESCHLIMANN, 1958). La larve ne se nourrit pas. On compte de 5 à 8 stades nymphaux; chaque nymphe prend un repas sanguin, puis mue. La femelle peut pondre plusieurs fois, mais doit toujours se nourrir pour effectuer un nouveau cycle gonadotrophique. La copulation a lieu pendant ou après le repas et n'influence pas la quantité de sang prélevé; elle est par contre absolument nécessaire pour permettre une vitellogénèse et une ponte normale (AESCHLIMANN, 1968, AESCHLIMANN & GRANDJEAN, 1973; GERMOND & AESCHLIMANN, 1977). 0. moubata vit en relations étroites avec l'homme. On la trouve dans les maisons, se nourrissant aux dépens des humains, des porcs, des poules, etc.. La souche utilisée ici provient de Tanzanie. Les tiques sont élevées suivant la méthode de GEIGY & HERBIG (1955), modifiée par AESCHLIMANN (1958), dans une enceinte thermostatée à 27°C où l'humidité relative est de 50 - 60 %. Ce faible taux d'humi- dité a l'avantage de diminuer fortement la présence de moisis- sures dans les élevages. La nutrition se fait sur cochons d'Inde. A partir du 4e stade nymphal, chaque tique est isolée et nourrie séparément. Les femelles obtenues, le plus souvent après la 6e mue, n'ont donc ainsi jamais été en présence de mâles. Ces femelles vierges sont utilisées pour nos différentes expériences. 8 2.1.1. Obtention de femelles nourries et ayant copule Les femelles vierges sont nourries et mises en présence de mâles (3 mâles pour 1 femelle) pendant 1 à 2 jours dans une boîte de Petri. Après 10 à 12 heures, presque toutes les fe- melles ont copule une ou plusieurs fois. Des dissections d'individus prélevés dans les différents lots le montrent clairement (présence de spermatophores dans l'utérus). 2.1.2. Obtention de femelles vierg.es nourries Après le repas sanguin, les femelles sont isolées pendant 100 jours environ. Ce laps de temps permet au vitellus accumulé dans les ovocytes de se résorber (GERMOND & AESCHLIMANN, 1977). 2.1.3. Obtention de femelles avant copule tardivement Des femelles vierges nourries depuis 100 jours environ sont mises en présence de mâles (3 mâles pour 1 femelle). Nous avons alors un phénomène de "copulation retardée", qui permet de distinguer expérimentalement les stimuli provenant de la copulation seule, de ceux inhérents à la nutrition (AESCHLIMANN, 1968). 2.1.4. Obtention de femelles ayant copule à jeun Mises en présence de mâles, les femelles à jeun copulent dans de faibles pourcentages, même après plusieurs jours de cohabi- tation. Pour pallier cette difficulté, les femelles sont collées sur le dos au fond d'une boîte de Petri. Vingt-quatre heures après l'introduction des mâles, elles sont presque toutes fécondées. 9 2.2. STIMULATION CHIMIQUE DE LA PONTE 2.2.1. Injections Les solutions aqueuses contenant la substance activant vitellogénèse et ponte sont injectées dans l'hémocoele des femelles, à raison de 5 Al par tique, selon GERMOND & AESCHLIMANN (1977). Les femelles témoins reçoivent de 1'"Arachnid Ringer" (ROTHSCHILD, 1961). 2.2.2. Préparation de la substance active contenue dans le spermiophore des mâles Quelques femelles sont placées durant 2 ou 3 jours en présence d'un fort excédent de mâles (env. 20 mâles pour 1 femelle). Elles sont ensuite disséquées dans une enceinte stérile et les spermiophores sont prélevés après ouverture des capsules spermatophoriques. Les spermiophores sont suspendus dans de l"Arachnid Ringer" (ROTHSCHILD, 1961). Ils sont ensuite centrifugés à basse vitesse (500 g, 5 min) et resuspendus dans 1'"Arachnid Ringer". L'opération est répétée 3 fois, afin d'éliminer au maximum les sécrétions des glandes accessoires mâles. La suspension finale (représentant le contenu d'environ 100 capsules dans 1 ml de solution) est mise à incuber pendant 24 h. à une température de 26 à 28° C. Les deux dernières étapes sont faites en asepsie complète. 2.2.3. Détermination du poids moléculaire par filtration sur ReI Après incubation, la suspension de spermiophores est centrifu- gée (SORVALL RC-5, 12'000 g, 10 min., 4° C). Le surnageant (env. 0,8 ml) est récolté et une fraction de celui-ci est appliqué sur une colonne de Sephadex G-200, ou de Bio-Gel A-5 M. 10 L'élution est faite à 4° C dans du NaCl 27, l>, avec un débit d'une goutte par minute (env. 60^1/min.). La pression hydrostatique est maintenue par une colonne d'eau de Ao cm. (vase de Mariette), Avant emploi, les colonnes sont stérilisées chimiquement à l'aide d'une solution d'azide de sodium (0,2 7.) et l'éluant est autoclave. Pour calibrer les colonnes, nous avons utilisé du Blue-Dextran 2000 (non retenu: volume d'exclusion du gel), du DNP-Alanine et des protéines standard (Serva, collection MS-II). L'étalonnage est fait avant et après élution du sur- nageant de spermiophores. Des fractions de 10 (600 UX) ou 20 (1200 /il) gouttes sont récoltées par un collecteur LKB. La détection UV est effectuée à 280 nm par un appareil UVICOElD, LKB. 2.2.4. Préparation des broyats de testicules. Rlandes annexes et vésicules séminales 40 mâles vierges et non-nourris (ayant mué depuis 1 à 2 mois) sont disséqués dans NaCl 2 %. Leurs appareils génitaux sont prélevés, lavés plusieurs fois et mis en suspension dans NaCl 2 7. suivant le schéma ci-après : Des essais préliminaires à l'aide de différents tampons phosphates comme éluants ont entraîné des taux de mortalité assez élevés chez les femelles. C'est la raison pour laquelle nous avons utilisé une solution saline simple. La concentra- tion de 2 ï, hypertonique par rapport à l'hémolymphe, permet de limiter au maximum 1'adsorption de molécules sur le Sephadex ou le Bio-Gel et est néanmoins très bien tolérée par les femelles lors de l'injection. 11 Dissection de 40 mâles I appareils génitaux (3 lavages) 400 UX suspension NaCl 2 % (bain de glace) I Broyât avec microhomogénéisateur en verre (bain de glace) \ Centrifugation (SORVALL RC-5, 12*000 g, 15 min., I 4° C) Surnageant (~ 350 «1) 150 ul sur colonne 200^1 pour injection (5 ,«1/9 => 1/2 a / ?) 2.2.5. Digestion enzymatique Les expériences de digestion enzymatique ont été faites au moyen de trypsine et d' °< - amylase ' insolubles (Sigma Chem. Comp.). La matrice de ces enzymes est constituée de Poly- acrylamide. On utilise, pour la digestion, du tampon phosphate KH2P04/Na2HP04 133 mM, pH 8,0. Mode opératoire : - préparation de broyats de vésicules séminales de mâles : comme sous 2.2.4. L'o<-amylase est utilisée comme témoin. 12 surnageant : 400 ul (là / 10^1) 100 u\ 150 ul + 50 /uX de + 75/il de + 75/tl de suspension tampon suspension Trypsine ---------1---------T- FIGIIRE 3 Examen de la distribution des poids de femelles vierges ------------- à jeun à diverses périodes : A: août 1977 B: septembre 1978 C: décembre 1978 26 m : poids moyen de l'échantillon s : écart-type n : nombre total d'individus Le test t de STUDENT n'étant donc dans ce cas pas utilisable, les moyennes ont été comparées par le test de la médiane. Ce dernier nous montre une différence hautement significative entre les lots 1 et 2 et également entre les lots 1 et 3 (P £- 0,01). Par contre, 2 et 3 ne se distinguent pas l'un de l'autre statistiquement (P >0,1). La moyenne des poids a donc diminué de 1977 à 1978 mais est restée stationnaire durant la fin de l'année 1978. Deux groupes de femelles vierges nourries depuis un jour ont été pesés, le premier en novembre 1977 (29 femelles) et le second en décembre 1978 (96 femelles). La répartition (fig. 4) paraît asymétrique mais on ne peut exclure une distribution normale pour le lot "décembre 1978" (X 0,95 = 15,5 pour V = 8, alors que notre /¾ vaut 11,7). En comparant les deux lots par un test de la médiane, on s'aperçoit que le poids moyen des femelles fraîchement nourries est plus élevé en automne 1978 qu'un an auparavant (différence significative à P<5 %) . Signalons que les pesées de décembre 1978 (femelles à jeun ; fig. 3 C et femelles nourries : fig. 4 B) concernent les mêmes individus. On peut constater d'ailleurs certaines similitudes dans la distribution des poids. Huit groupes de femelles vierges nourries depuis 100 jours ont été pesés entre août 1975 et avril 1979 (fig. 5). On remarque une augmentation graduelle de la moyenne des poids au cours du temps (fig. 6). Quoique cette augmentation semble se stabiliser depuis 1977, nous obtenons une bonne corrélation entre le temps et le poids (r significatif à 0,02). Sur la figure 5, les différents échantillons ne semblent pas montrer une distribution normale. En opérant un test de ?d , il apparaît que, pour un seuil égal à 0,95, les lots : janvier 2Â< juin 76 et avril 79 ne peuvent être assimilés à une distri- 2 bution normale. Pour les autres échantillons, le P( est juste 2 inférieur au X limite des tables. Certains de ces lots parais- sent présenter un caractère bi- ou plurimodal dans leur distribution. 27 nombre d individus 25> -I------1------r- m = 183,8 mg s= 52,7 mg n = 29 -4=3- B poids en mg m = 217,5 mg s = 58,9 mg n = 96 FIGURE 4 28 Examen de la distribution des poids de femelles vierges nourries depuis 1 jour, à diverses périodes : A : novembre 1977 B : décembre 1978 m : poids moyen de l'échantillon s : écart-type n s nombre total d'individus août 75 «H janv. 76 juin 76 nov. 76 juin 77 nov. 77 juin 78 avril 79 m-i-i ^n ihn- m = 63,9 mg s= 22,2 mg n = 89 99,8 mg 40,1 mg 103 m = 100,2 mg s= 43,2 mg n 161 m = 142,2 mg s = 68,0 mg n = 98 m = 120,6 mg s = 44,7 mg n = 222 164,4 mg 67,2 mg 199 m = 151,3 mg s= 53,1 mg n = 225 m = 141 4 mg s n = 54 249 / mg IGURE 5 Examen de la distribution des poids de femelles vierges nourries depuis 100 jours, à diverses périodes. m i poids moyen de l'échantillon s i écart-type n ! nombre total d'individus __ 29 Figure 6 Evolution au cours du temps du poids moyen de femelles vierges nourries depuis 100 jours (les données sont reprises de la figure 5). La droite figurée représente la droite de régression (y = 1,769 x + 74,10). Les segments verticaux correspondent aux écarts - types. 30 3.1.2. Corrélation entre le poids à jeun et Xe poids sorge des femelles Dans l'éventail des paramètres étudiés sur notre élevage, il était intéressant également de savoir s'il existait une relation entre le poids d'une femelle avant et après son repas de sang. Nonante-six femelles ont été pesées avant la prise de sang ainsi que le lendemain du repas, après expulsion du liquide coxal. Il existe une très bonne corrélation (©< < 0,01) entre les deux poids obtenus (fig. 7). Ainsi, une grosse femelle prend beaucoup plus de sang qu'une petite. De plus, afin de disposer d'un paramètre stable pour la suite de notre travail, nous avons calculé le rapport entre poids gorgé et poids à jeun d'une même femelle (R-,) et en avons établi la distribution (fig. 8). R, semble distribué normalement, la valeur du ?L (2,19) étant située au-dessous de X limite (7,81). La moyenne (4,97) indique qu'une femelle quintuple à peu près son poids lors du repas. 3.1.3. Corrélation entre le poids de sanR inséré et le nombre d'oeufs pondus La quantité de sang ingéré par 20 femelles a été estimée en pesant les individus avant leur repas sanguin et le jour sui- vant celui-ci, après expulsion du liquide coxal. Il existe une très bonne corrélation (c<<0,01) entre la quantité de sang ingéré et le nombre d'oeufs pondus par les femelles (fig. 9). D'autre part, le rendement de ponte (R2 = nombre d'oeufs / poids de sang ingéré) a été calculé pour chaque individu. La valeur moyenne obtenue est 0,72 mg" . Cela signifie que, pour chaque milligramme de sang concentré de cobaye, une femelle pondra 0,72 oeufs. 31 3 Q) Q) H C V O CtJ Q) JJ a Cf-I O'O) «-I U ! / (D g- W s 32 Ii ¦> *-h U 2™ ZX •» (D - O •i-i in + ¦ E O r- Os r-> O Ov r-* » W. Ll Il Q) e K N^" E- 'IO •3 IO ¦8 -5 •3 ¦8 ¦3 00 M O 00 T O CU 1.1 O • IO IV ci OS O 33 b o T^ SE & C -ss J3 O) B co »•• O "O) II C Vi a 0 (B i-t h O S VJ © (M D'CD CO Vj .(B ffi U -ri - J-I Cu ^. C u"> 0) (B - O JJ IA O Cl -H H O O O (B co - SO © O S CrH •H i-l II 7- (D oce >> e œ -^ (S lu (O C CO O d) (B -rJ X) X) co (O CO Vj O) O •O (O Vj O ¦na« o >« a re u 3 3 Xl 0) X) C X) O cu a. cu U J-) C CO -rJ Cl) im O S 3 3 Vj r-( (B Xf ij-i O C- « W X) r-J 3 O 34 3.1.4. Corrélation entre le nombre d'oeufs pondus et le poids de femelles nourries depuis 100 jours Dans la plupart de nos expériences, nous avons utilisé des femelles nourries depuis 3 à 4 mois, sans connaître leur poids à jeun. Cent-vingt-quatre de ces femelles ont donc été pesées et leur poids a été mis en relation avec le nombre d'oeufs qu'elles ont pondu après copulation retardée (fig. 10). Il existe une très bonne corrélation (°<< 0,01) montrant que la quantité d'oeufs pondus augmente avec le poids des femelles. En conséquence, nous pouvons utiliser comme critère de productivité le rapport _ ( nombre d'oeufs pondus \ 3 *• poids de la femelle plutôt que de considérer uniquement le nombre d'oeufs pondus, ce paramètre étant beaucoup trop variable d'une tique à l'autre. En reprenant les 124 femelles ci-dessus, nous pouvons étudier la distribution du rapport Ro (fig. 11). Celle-ci semble normale au vu du test de?t . La moyenne (0,50 mg" ) signifie qu'une femelle nourrie depuis 100 jours va pondre 1 oeuf pour 2 mg de son poids. 3.1.5. Poids d'un oeuf L'oeuf d'Ornithodoros moubata a une taille relativement grande par rapport à celle de certaines autres espèces de tiques, les Ixodides en particulier. Son diamètre est voisin de 1 mm (AESCHLIMANN, 1958). Nous avons prélevé, au hasard et à des dates différentes, 4 lots d'oeufs fraîchement pondus, provenant chacun d'une autre femelle. Les pesées ont montré une très faible variabilité du poids moyen d'un oeuf, d'un lot à un autre (Tableau 2). 35 nom bra d'oouf* pondu* - 200 150 100- 50- (r i coefficient de corrélation) (pour V = 122 et ex = 0,01, r limite = 0,230) r i i i i ¦ I i i i i i i i 100 2OO 300POJd.*. Ia tomoli« FIGURE 10 36 Influence du poids de femelles nourries depuis 100 jours et ayant subi une copulation retardée, sur le nombre d'oeufs pondus. La droite figurée représente la droite de régression (y = 0,541 x - 5,73). O O 0> IM r-1 O X: U"l O Ii r-C i-l a Li a JC O) - u »4 m B o ** ri O U U D fc a) u > 0) I n ». 3 » C 1----- cd r-i 00 0) U ¦°i co ¦«-> •o •08 Il PO 02 JJ U O a a id u ¦3 0.4 3 •^ H P S) O -»J O t> «1 r-l ¦d X O 0! T3 co C C O X) ,4) Li a id 37 ponte no nombre d'oeufs poids (mg) de la ponte poids moyen d'un oeuf (mg) 1 27 14,50 0,537 2 53 29,10 0,549 3 29 15,84 0,546 4 24 12,77 0,532 Tableau 2 : Poids moyen d'un oeuf fraîchement pondu estimé sur 4 pontes différentes. L'oeuf d'O. moubata pèse donc environ 0,54 mg. En reprenant le rapport FU, on peut estimer qu'une femelle pondra 0,39 mg d'oeufs pour chaque mg. de sang concentré de cobaye. D'autre part, on peut également calculer le rendement de la ponte d'un individu nourri depuis 100 jours. La valeur moyenne correspond à 0,27 mg d'oeufs produits pour 1 mg de poids total de l'animal (calculé d'après le rapport Ro). 3.1.6. Poids des ovaires secs Lors de la vitellogénèset le poids de l'ovaire augmente considérablement à mesure que les ovocytes s'emplissent de vitellus. Selon GERMOND & AESCHLIMANN ( 1977 ), le vitellus des ovocytes de femelles vierges (qui ne pondent donc pas) est résorbé 100 jours après la nutrition. Les ovaires de femelles appartenant à trois lots différents ont été pesés : tout d'abord, ceux de femelles vierges à jeun (diamètre des ovocytes env. 100il), ensuite ceux de femelles vierges et nourries depuis 100 jours (diamètre des ovocytes 38 env. 150li ) et finalement ceux de femelles nourries en tant que vierges, avant copule après 100 jours (copulation retardée : AESCHLIMANN, 1968) et dont l'ovaire a été prélevé 2) 8 jours après la copulation . Le tableau 3 montre claire- ment de fortes différences de poids entre les ovaires des 3 catégories. état physiologique des femelles nombre de femelles poids moyen d'un * ovaire sec (j^g) 9 9 vierges à jeun 37 80 t 30 99 vierges nourries depuis 100 jours 59 220 t 80 99 8 jours après la copulation (copulation retardée: 100 jours après le repas sanguin) 7 2'390 - 920 Tableau 3 : Estimation du poids moyen d'un ovaire sec chez des femelles dans différents états physiologiques. + m - s m : moyenne s s écart-type D 2) Le vitellus est résorbé, mais les ovocytes ne reviennent pas vraiment à leur taille primitive. Leur diamètre correspond à peu près à celui des ovocytes en fin de période de prévitellogénèse (DIEHL, 1970). A ce stade, les ovocytes sont lourdement chargés de vitellus (diamètre entre 500 et 800,0 et l'ovulation n'a pas encore commencé. Certains individus montraient néanmoins une vitellogénèse beaucoup moins avancée. Cela explique l'écart-type très élevé du tableau 3 (lot 3). 39 Cent jours après le repas, les ovaires secs sont encore trois fois plus lourds que chez l'individu à jeun. L'ovaire d'une femelle vierge ayant résorbé son vitellus n'est donc pas directement comparable à celui d'une femelle à jeun. Il con- tient une quantité plus élevée de matière. Le troisième lot indique, malgré une forte variabilité individuelle, un décu- plement du poids sec dans les 8 jours suivant la copulation chez les femelles vierges nourries depuis 100 jours. 3.2. ACTION DE LA COPULATION SUR LA VITELLOGENESE ET LA PONTE : FACTEUR CHIMIQUE DU MALE 3.2.1. Détermination du poids moléculaire de la "substance active" du mâle La "substance active" mise en évidence par GERMOND & AESCHLIMANN (1977) est récoltée à partir des spermiophores du mâle. L'in- jection de cette substance à 19 femelles vierges et nourries depuis 100 jours induit la ponte dans tous les cas (fig. 12). Des témoins constitués par des femelles ayant copule et reçu une solution de NaCl 2% pondent également, dans 94 °L des cas. Ceci ne correspond pas à une différence significative avec le lot précédent. Une Chromatographie d'exclusion de gel à l'aide d'une colonne de faible diamètre et d'un échantillon de volume relativement important (fig. 12) nous a donné une approximation du poids moléculaire de la "substance active". Un biotest a permis de tester chacune des fractions éluées sur la colonne. La "substance active" a un volume d'élution correspondant à celui du Blue-Dextran, qui est l'indicateur du "volume vide" de la colonne. Cette substance, totalement exclue du gel, a donc un poids moléculaire supérieur à 800'000. Le passage du Blue-Dextran et de la DNP-Alanine n'étant pas opéré simultanément avec le mélange actif sur la colonne, l'é- ventualité d'une liaison Blue-Dextran - Substance active est Equivalent de 0,5 capsules spermatophoriques par femelle, 40 (Xd* 99 ayant pondu) Témoins 100-- Fractions éluôot |Bluo-Ooxtr>n| ONP-Alanino RESULTATS OU BIOTEST jxQ. a &\à\$S Fl* Flir« FIT Fl* FH FlO f H FH FH FJ* FIS Fl* FÎT FUFMFSPf 31 F 33 F ""["'I. (lot.) L |jtiAlAlàlHftlAlAl^HM*m*)ffl*l»ltitiWrfrrWtilFa FIGURE 12 Détermination du poids moléculaire (le étape) de la substance active du surnageant de spermiophores, par biotest des fractions obtenues après Chromatographie d'exclusion de gel. La colonne est longue de 60 cm et son diamètre mesure 9 mm. Le gel (Sephadex G-200) permet la séparation des protéines de poids moléculaires compris entre 5'000 et SOO'OOO. Un volume de 700 pS- est appliqué sur la colonne, et des fractions de 1,2 ml (20 gouttes) sont récoltées. Le biotest est effectué sur des femelles vierges et nourries depuis 100 jours, pour chacune des fractions t - TE NaCl - TE AR - TE Cop + NaCl - Sum. SpIo. - Mei Frac. - F 12 témoins recevant NaCl 2 X témoins recevant du Ringer pour Arachnides témoins ayant copule recevant NaCl 2 X lot recevant l'échantillon brut (avant passage sur la colonne). lot recevant un mélange à parts égales des fractions F 12 à F 35. lot recevant la fraction No 12. lot recevant la fraction No 35 41 impossible. Le test de probabilité exacte de FISHER nous montre que, lors du biotest, les réponses obtenues avec les fractions F 13 et F 14 diffèrent de celle résultant d'une injection de NaCl à 2 % (différence hautement significative : P<1 ï) (Tableau 4). D'autre part, la fraction F 13 donne une meilleure stimulation de la ponte que la fraction F 12 (P<5 %) . Lots comparés Différence significative àP<5 7. TE Cop + NaCl - Sum.Spio non (P = 65 %) TE NaCl - F12 non (P = 9,3 %) TE NaCl - F13 oui (P = 0,03 7.) TE NaCl - F14 oui (P = 0,69 %) TE NaCl - F15 non (P = 7,8 7.) TE NaCl - F16 non (P = 14,7 %) TE NaCl - F18 non (P = 52 %) TE NaCl - F20 non (P = 43 %) TE NaCl - Mei Frac. non (P = 43 7.) F12 " F13 oui (P = 4^1 7.) F14 " F13 non (P = 25 %) F15 - F13 non (P = 6,3 7.) Tableau 4 ; Substance active du mâle : comparaisons statistiques par le test de probabilité exacte de FISHER (alternative simple) des différentes réponses enregistrées lors du biotest effectué avec les fractions obtenues après la première étape de la détermination du poids moléculaire. La signification des abréviations est donnée dans la légende de la fig. 12. Les probabilités inférieures à 5 % (soulignées) correspondent à une différence significative des deux lots comparés. 42 Le mélange des différentes fractions (F 12 à F 35) a également été soumis au biotest. Une seule femelle parmi 9 a pondu. Il n'a donc pas été possible de montrer une activité nette de ce mélange. Ceci peut être dû à une dilution excessive de notre échantillon. La substance active recherchée se comporte comme étant de très haut poids moléculaire. Ceci nous a conduit à utiliser le Bio-Gel A-5 M, permettant une plage de séparation plus étendue. Nous basant sur les résultats de la première étape, le biotest n'a été effectué que sur les fractions de haut poids moléculaire. Les résultats sont consignés sur la figure 13. La "substance active" appa- raît avec un maximum d'intensité à la fraction F 17. Les fractions F 16, F 17 et F 18 donnent des réponses significati - vement différentes de celles des témoins (P<5 %) (Tableau 5). On peut donc placer le pic d'activité de la substance dans la zone d'élution comprise entre 315 et 345 gouttes. Après éta- lonnage de la colonne et suivant la droite obtenue, ces valeurs correspondent à un poids moléculaire situé entre l'500'000 et 4'100'000. Comme précédemment, la "substance active" brute a été injectée à 19 femelles et a provoqué un fort pourcentage de pontes. Toutefois, ce pourcentage était légèrement inférieur à celui obtenu chez les femelles témoins ayant copule et reçu une injection de NaCl, sans qu'une différence significative soit décelable. Le mélange des fractions (lot MeI. Frac, dilution de facteur 25 par rapport à Surn. Spio) ne montre aucune réponse. La dilution paraît trop importante pour conserver des propriétés gonadotropes à la solution. Un calcul simple nous indique une dilution d'environ 40 fois entre Surn. Spio et Mei. Frac. 43 logPM (% d« W »y»nt pondu) Témoins 100 TE TE TE Su. W*tfHfrW |Blu«-D«xtran| 4ÓO 5Ó0 Fractions élûtes |DNP-Al.nin«"| RESULTATS DU BIOTEST FIO Fil Fïî fil \4\4.\mi+mìHttói*mmti\ (lots) FIGURE 13 Détermination du poids moléculaire (2e étap*?) de la substance active du surnageant do spormiophores, par biotest des fractions obtenues après Chromatographie d'exclusion de gel. Lo résultat du test est comparé à une droite étalon établie par élution de protéines standards. La colonne est longue de 60 cm et son diamètre mesure 9 mm. Le gel (Bio-Gel A-5M) permet la séparation des protéines de poids moléculaires compris entre 10'0OO et vooo'ooo. lin volume de 700 ^d est appliqué sur la colonne et des fractions de 1,2 ml (20 gouttes) sont récoltées. Le biotest est effectué sur des femelles vierges et nourries depuis 100 jours, pour chacune de s f rac t i on s t - TE NaCl - TE AR - TE Cop + NaCl - Sum. Solo. - Mei. Frac. - F 10 témoins recevant NaCl 2 % témoins recevant du Ringer pour Arachnides témoins ayant copule recevant NaCl 2 % lot recevant l'échantillon brut (avant passage sur la colonne) lot recevant un mélange à parts égales des fractions F 10 à F 23. lot recevant la fraction No 10 lot recevant la fraction No 23 - F 23 Equation de la droite de régression i y = - 0,014A x + 11,152 44 Lots comparés Différence significative à P sä 5 % Sum. Spio. - TE Cop+NaCl non (P = 25,2 7.) TEAR - Sum.Spio oui (P<0.01 7.) TE NaCl - F16 oui (P = 4^7 7.) TE NaCl - F17 oui (P = 0.08 7.) TE NaCl - F18 oui (p = 2^o y.) TE NaCl - F19 non (P = 16,3 7.) F16 - F17 non (P = 17,3 7.) F18 " F17 non (P = 24,2 7.) F19 " F17 non (P = 5,5 7.) Tableau 5 s Substance active du mâle : comparaisons statistiques par le test de probabilité exacte de FISHER (alternative simple) des différentes réponses enregistrées lors du biotest effectué avec les fractions obtenues après la deuxième étape de la détermination du poids moléculaire. La signification des abréviations est donnée dans la légende de la fig. 13. Les probabilités inférieures à 5 % (soulignées) correspondent à une différence significative des deux lots comparés. 45 Cette dernière expérience nous permet donc de situer le poids moléculaire apparent de la "substance active" entre 1,5 -10 et 4,1 - 106. Pour affiner les résultats, nous avons donc pris une colonne de plus fort diamètre et réduit le volume de l'échantillon et des fractions. Le calibrage de la colonne a été amélioré par augmentation du nombre de protéines étalons (fig. 14). Le biotest a été effectué sur 11 fractions seulement, au vu des résultats précédents. Nous trouvons une activité dans toutes les fractions situées entre F 81 et F 85, le maximum étant localisé au niveau de F 83. Ce dernier échantillon est d'ailleurs le seul à donner une réponse différant significativement de celle de TE NaCl (Tableau 6). De façon logique, nous pouvons localiser le pic d'activité entre 815 et 830 gouttes, ce qui correspond à un poids moléculaire compris entre l'600'OOO et l'900'0O0. Pour cette troisième expérience, il est frappant de constater, dans l'ensemble, des réponses relativement faibles, comparées à celles des deux premières expériences. En effet, même pour la fraction F 83, moins du 40 % des femelles pondent. Ce phénomène pourrait être expliqué par le faible volume de l'échantillon appliqué et la capacité relativement grande de la colonne; ces deux facteurs entraînent une plus forte dilution de la substance dans les fractions. Nous verrons plus loin (Tableau 7) l'influence de di- verses dilutions sur la réponse des femelles. Ici également, les différences ne sont pas significatives entre les deux lots de témoins ayant copule. Les injections d'échan- tillon brut semblent stimuler la vitellogénèse et la ponte de façon comparable à la copulation (différence non-significative entre les lots concernés) (Tableau 6). 46 (lot.) W«CI AK -IhO -AB Sg* lFTT FT« FTt FtO Fl FM FM FM Ff FW Ft7 Pt WpowoawT, TOTAL DC 9 FIGURE 14 Détermination du poids moléculaire (3e étape) de la substance active du surnageant de sperratophores, par biotest des fractions obtenues après Chromatographie d'exclusion de gel. Le résultat du test est comparé à une droite étalon établie par élution de protéines standards. La colonne est longue de 60 cm et son diamètre mesure 15 mm. Le gel (Bio-Gel A-5M) permet la séparation des protéines de poids moléculaires compris entre 10'0OO et 5'000'00O. Un volume de 150 ul est appliqué sur la colonne et des fractions de 0,6 ml (10 gouttes) sont récoltées. Le biotest est effectué sur des femelles vierges et nourries depuis 100 jours, pour chacune des fractions t - TE NaCl - TE AR - TE Cod + NaCl - TE Cop + AR - Surn. SpIo. - F 77 témoins recevant NaCl 2 X témoins recevant du Rtnger pour Arachnides téiaoins ayant copule recevant NaCl 2 % témoins ayant copule recevant du Ringer pour Arachnides lot recevant l'échantillon brut (avant passage sur la colonne) lot recevant la fraction No 77 - F 87 i lot recevant la fraction No 87 Equation de la droite de régression t y = - 0,0046 x + 10,027 47 Lots comparés Différence significative àP<5 7. TE AR - Sum. Spio. oui (P = 0,01 %) TE Cop + AR - TE Cop + NaCl non (P = 28,1 7.) Sum, Spio - TE Cop + AR non (P = 64 7.) Sum. Spio. - TE Cop + NaCl non (P = 22,2 %) TE NaCl - Fg1 non (P = 26 7.) TE NaCl - Fg2 non (P = 5,6 %) TE NaCl - Fg3 oui (P = ljji 7„) TE NaCl - Fg4 non (P = 52 7.) TE NaCl - Fg5 non (P = 50 %) F81 " F83 non (P = 15 7.) F82 " F83 non (P = 47 %) F84 " F83 non (P = 5,8 7.) F85 " F83 non (P = 7,3 %) Tableau 6 : Substance active du mâle : comparaisons statistiques par le test de probabilité exacte de FISHER (alternative simple) des différentes réponses enregistrées lors du biotest effectué avec les fractions obtenues après la troisième étape de la détermination du poids moléculaire. La signification des abréviations est donnée dans la légende de la fig. 14 . Les probabilités inférieures à 5 7. (soulignées) correspondent à une différence significative des deux lots comparés. 48 3.2.2. Injections de brovats de testicules, glandes annexes et vésicules séminales Afin de préciser les résultats de GERMOND & AESCHLIMANN (1977), des testicules, glandes annexes et vésicules séminales ont été broyés et centrifugés. Le surnageant obtenu, ainsi que les différentes fractions obtenues après son passage sur une colonne de Bio Gel A-5 M, ont été injectés a des femelles. 3.2.2.1. Glandes annexes et testicules Les surnageants obtenus par broyât de glandes annexes ou de testicules ainsi que les différentes fractions d'élution de ces surnageants n'ont pas provoqué de ponte chez les femelles vierges nourries depuis 100 jours. Leur dissection, 25 jours après l'injection,a montré que les ovaires ne présentaient aucun signe de vitellogénèse. Bien qu'une action protéolytique due à des enzymes intrin- sèques ne soit pas totalement à exclure, il semble que la substance recherchée ne soit pas présente dans les testicules ou les glandes annexes du mâle. 3.2.2.2. yésicules séminales Des surnageants de broyats de vésicules séminales (équiv. 1/2 <5 par î) ainsi que différentes dilutions de ces surnageants ont été injectés à des femelles vierges, nourries depuis 100 jours (Tableau 7). Les témoins ayant copule et reçu NaCl 2 % pondent dans 93 % des cas, les femelles ayant été injectées avec le broyât brut dans 71 % des cas. L'activité de la substance décroît ensuite avec sa dilution progressive. Tous les individus qui n ont pas pondu ont été disséqués. Nous n'avons observé aucun ovaire en vitellogénèse. Des broyats de vésicules séminales sont donc capables de provoquer la ponte lorsqu'ils sont injectés à des femelles vierges nourries depuis 100 jours. En revanche, les fractions récoltées à la sortie d'une colonne ne montrent aucune activité, du moins pour la zone de poids molé- culaire testée, laquelle est située entre 1,1- 106 et 2,8- 10 . 49 lot nombre de ¥9 pondant nombre total de 99 % de 99 pondant TE NaCl TE Cop + NaCl VS brut VS brut D5 VS brut D25 0/18 14/15 10/14 8/16 1/17 0 93 71 50 6 Tableau 7 : Injection de broyats de vésicules séminales à des femelles vierges et nourries depuis 100 jours : pourcentage de femelles ayant pondu après 25 jours. TE NaCl : femelles témoins ayant reçu NaCl 2 %. TE Cop + NaCl : femelles témoins ayant copule et recevant NaCl 2 %. VS brut : femelles ayant reçu le surnageant d'un broyât de vésicules séminales avant passage sur la colonne (équiv. 1/2 3 par 9). VS brut D5 : idem VS brut, mais dilué 5 fois avec NaCl 2 % (équiv. 1/10 à par 9). VS brut D25 : idem VS brut, mais dilué 25 fois avec NaCl 2 X (équiv. 1/50 â par 9). L'analyse statistique confirme une très bonne activité du broyât jusqu'à la dilution 5 (équiv. 1/10 à par 9), ce qui permet d'exclure la possibilité d'une trop faible concentration dans l'éluat (Tableau 8). Pour la dilution 25, la solution devient pratiquement inactive, le test statistique utilisé ne montrant pas de différence significative avec les témoins. 50 Lots comparés Différence significative à P < 5 % TE NaCl - VS brut oui (P < 0.01 %) TE NaCl - VS brut D5 oui (P = 0.07 7.) TE NaCl - VS brut D25 non (P = 49 %) VS brut - TE Cop + NaCl non (P = 14 %) VS brut D5 - VS brut non (P = 21 %) VS brut D25 - VS brut oui (P = 0.02 %) VS brut D25 - VS brut D5 oui (P = 0,60 7.) Tableau 8 : Comparaisons statistiques par le test de proba- bilité exacte de FISHER (alternative simple) des différentes réponses enregistrées après injection de broyats de vésicules séminales. La signification des abréviations est donnée dans la légende du tableau 7. Les probabilités inférieures à 5 % (soulignées) correspondent à une différence significative des deux lots comparés. Nous avons montré qu'il existait une bonne corrélation entre le poids d'une femelle vierge nourrie depuis 100 jours et le nombre d'oeufs qu'elle pondra après une copulation retardée. Le rapport Ro est distribué normalement, ce qui permet la comparaison d'échantillons par un test t de STUDENT. Nous avons comparé ainsi 3 lots entre eux (Tableaux 9 et 10). Les rendements moyens sont très voisins les uns des autres (0,43<;r3 <0,52). Le test t de STUDENT ne permet pas de con- clure à une différence significative au seuil de 5 %. Ceci laisse supposer que l'action de la substance stimulant la vitellogénèse et la ponte est plutôt du type "tout ou rien". 1) défini sous 3.1.4. nb. d'oeufs pondus poids de la femelle 51 Lot nombre de ¥9 pondu ayant — * R3 TE Cop + NaCl 14 0,44 - 0,07 VS brut 10 0,52 t o,14 VS brut D5 8 0,43 - 0,07 Tableau 9 : Injection de broyata de vésicules séminales : calcul du "rendement" moyen des pontes de 3 lots. * _ nombre d'oeufs pondus 3 poids de la femelle en mg La signification des abréviations est donnée dans la légende du tableau 7. Lots comparés t TE Cop + NaCl - VS brut 1,85 TE Cop + NaCl - VS brut D5 0,32 VS brut - VS brut D5 1,65 Tableau 10 : Injection de broyats de vésicules séminales : comparaisons statistiques des "rendements" moyens R3 par le test t de STUDENT. Aucune différence n'est détectée entre les lots comparés à un seuil de 5 %. La signification des abréviations est donnée dans la légende du tableau 7. 52 3.2.3. Femelles nourries une deuxième fois après stimulation chimique de la vitellogénèse et de la ponte Toutes les tiques ayant pondu après injection d'homogénat de vésicules séminales ont été nourries une nouvelle fois 78 jours après l'injection. Nous avons également donné un deuxième repas de sang aux femelles témoins de la même expérience (vierges ou non). Après 25 jours, des pontes ont été enregistrées dans tous les lots, sauf chez les témoins vierges (Tableau 11). La totalité des femelles ont pondu, sauf une exception pour la dilution 5. L'injection d'homogénats de vésicules séminales provoque donc un stimulus qui persiste très longtemps. Lot nombre nombre de 9? total pondant de ¥? 7. de SS pondant TE Cop + NaCl 7/7 100 TE NaCl 0/15 0 VS brut 9/9 100 VS brut D5 6/7 86 TABLEAU 11 : Etude de la persistance de l'effet gonadotrope d'un broyât de vésicules séminales ! Pourcentages de ponte, obtenus après seconde nutrition de femelles ayant déjà pondu une fois. Cent jours après le premier repas sanguin, les femelles ont reçu une injection d'un broyât de vésicules séminales, ce qui a provoqué la première ponte. Le deuxième repas sanguin s'est déroulé 78 jours après cette injection. Pour les abréviations utilisées, voir Tableau 7. Ces femelles, n'ayant pas pondu lors de la première expérience, se sont tout de même nourries sans problèmes 78 jours après l'injection de la solution saline. 53 3.2.4. Digestion de la substance active par la trypsine Il ressort des expériences susmentionnées ainsi que des travaux de GERMOND & AESCHLIMANN (1977) que la substance active pourrait être une protéine (thermolabilité, haut poids moléculaire). Pour essayer de vérifier cette hypothèse, nous avons tenté une digestion enzymatique à l'aide de trypsine insoluble et en utilisant comme témoin un échantillon subissant une digestion dans l'cx.-amylase, insoluble également. Comme source de substance active, nous avons pris un surna- geant de broyats de vésicules séminales . Les injections ont été faites sur 4 lots (Tableau 12) et les pontes contrôlées après 25 jours . Lot nombre nombre de 99 total pondant de 99 % de 9 9 pondant 9 9 ayant copule: injection de tampon phosphate 12/20 60 9 9 vierges : injection de surnageant non traité 11/21 52 99 vierges : injection de surnageant traité par la trypsine (30" à 30°C) 8/14 57 99 vierges : injection de surnageant traité par !'amylase (30' à 30°C) 9/17 53 TABLEAU 12 : Effet d'une digestion enzymatique de la substance produite par le mâle sur son pouvoir d'induction de la vitellogénèse et de la ponte chez la femelle vierge. Les surnageants des broyats de vésicules séminales sont soit injectés directement, soit traités par la trypsine ou 1'amylase. Préparation selon matériel et méthodes : NaCl 2 % est remplacé par un tampon phosphate pH 8,0; 133 mM, 54 Relevons tout d'abord que les témoins ayant copule n'ont pondu que dans le 60 % des cas. Cette situation est peut-être due au tampon phosphate qui peut présenter certains effets toxiques à l'Injection. Néanmoins, on observe que les variations entre les réponses de chaque lot ne sont pas significativement différentes (test de probabilité exacte de FISHER). Par conséquent, l'acti- vité ne semble pas avoir diminué sous l'effet de la trypsine. A titre de comparaison, nous avons effectué une digestion témoin dans les mêmes conditions expérimentales, mais en pre- nant la caséine comme substrat (concentration initiale : 6 mg/ml). Après 30 minutes, l'enzyme avait digéré plus des 95 % de la substance. 3.3. ACTION DE LA COPULATION SUR LA VITELLOGENESE ET LA PONTE : STIMULATION MECANIQUE 3.3.1. Stimulation mécanique par implantation de billes métalliques dans le vagin et l'utérus Afin de déterminer le rôle de la stimulation mécanique opéré par la copulation, nous avons mimé celle-ci en introduisant des billes métalliques dans le vagin et l'utérus de femelles vierges, nourries depuis 100 jours. Une semaine plus tard, une partie des femelles ont été dissé- quées et leur ovaire pesé après dessication. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 13. Le poids moyen des ovaires des femelles stimulées par les billes d'acier est très nettement supérieur à celui des témoins non traités et ne diffère pas statistiquement de celui des femelles ayant copule (Tableau 14). Ceci confirme l'observation des ovocytes lors de la dissection. Ceux-ci étaient pour la plupart déjà fortement chargés de vitellus. 55 lot nombre d'individus poids moyen d'un ovaire sec (/8) TE Cop 5 1500 + 1360 TE 10 270 t 170 B 10 1060 "t 680 Tableau 13 ! Mesure du poids sec d'ovaires de femelles vierges traitées à l'aide de billes d'acier dans l'utérus. Les organes sont prélevés et pesés 7 jours après le traitement. TE ! femelles témoins n'ayant subi aucune manipulation B s femelles traitées avec des billes d'acier TE Cop : femelles témoins ayant copule lots comparés différence significative à P < 5 % TE-B oui (P = OJ, %) TE - TE Cop oui (P = 0^7 7.) B-TE Cop non (P = 43 %) Tableau 14 : Stimulation mécanique de la vitellogénèsei comparaisons statistiques par le test de la médiane des données du tableau 13. La signification des abréviations est donnée dans la légende du tableau 13. Les probabilités inférieures à 5 7, (soulignées) correspondent à une différence significative des deux lots comparés. 56 La plupart des femelles pondent dans les 25 jours suivant le traitement. Le pourcentage de pontes est un peu plus élevé chez les témoins ayant copule que chez les individus stimulés mécaniquement (Tableau 15). La différence n'est cependant pas significative (test de probabilité exacte de FISHER : P = 43 %). Par contre, le rendement est supérieur chez les témoins ayant copule. Le test t de STUDENT le confirme (P< 5 %) . Nous n'avons pas nourri à nouveau les femelles stimulées mécanique- ment. Nous ne savons donc pas si ce mode d'action est "mémorisé", comme c'est le cas après injection de la substance active (voir 3.2.3.). 3.3.2. Synergie entre stimulation mécanique et chimique Ayant établi qu'une stimulation mécanique pouvait provoquer la ponte chez des femelles vierges, il devenait intéressant de voir s'il existait une synergie entre ce genre d'action et un stimulus lot nombre de 59 pondant nombre total de 99 % de 99 pondant R3 (mg X) TE Cop TE B 7 8 0 15 11 Î5 88 0 73 0,59 ± 0,10 0,42 t 0,19 Tableau 15 : Effet de la stimulation mécanique de l'utérus par des billes d'acier sur la ponte. 7T~ j„ ^nombre d'oeufs pondus \ R3 = rendement moyen (polds de ia femelle en mg? La signification des abréviations est donnée dans la légende du tableau 13. 57 chimique (voir 3.2.), Plusieurs combinaisons de ces deux traitements ont été utilisées afin de tester leurs effets sur le pourcentage de femelles pon- dant, le rendement moyen de ponte et le poids moyen des ovaires secs des femelles. Les résultats sont consignés au tableau 16. Le poids sec des ovaires, prélevés après une semaine, est très variable. Néanmoins, nous observons dans l'ensemble un net accroissement du poids sec de l'ovaire chez les femelles traitées (ou ayant copule ') par rapport aux témoins vierges. Vingt-cinq jours après le traitement, les pontes des invididus restant ont été répertoriées. Selon les lots, 40 à 100 "L des femelles traitées ont pondu. Seuls les témoins vierges n'ont pas réagi. Les pour- centages de ponte obtenus avec le traitement par les billes d'acier sont toutefois toujours inférieurs à ceux résultant d'une stimulation chimique ou d'une combinaison entre les stimulations mécaniques et chimiques. Il est à noter qu'aucune différence si- gnificative n'a pu être mise en évidence entre ces deux derniers lots (Tableau 17). Il semble donc que l'injection de substance active ait une action gonadotrope plus puissante que la distension du vagin et de l'utérus provoquée par les billes. D'autre part, le rendement de ponte Rq a été estimé et ne semble pas varier considérablement selon les lots. Les valeurs de t (Tableau 17), bien inférieures aux limites des tables, montrent que ces rende- ments ne sont pas statistiquement différents entre eux. Il ressort donc que les deux types de stimuli font pondre les femelles. L'action mécanique seule semble cependant plus faible que la copulation naturelle. Le double stimulus ne donne pas une meilleure réponse que le traitement chimique seul. Les rendements Rt, quoique faibles dans l'ensemble, sont tous comparables entre eux. Les 5 femelles, disséquées après 10 jours et provenant du lot de témoins ayant copule, ont montré des ovaires sans signes visibles de vitellogénèse. Nous n'avons pu expliquer ce résultat négatif, d'autant plus que les autres tiques de ce lot ont pondu dans 90 % des cas avant 25 jours. 58 QJa: co tu -* 3 ta so > o*ai r-4 G 3 3 U - «-* ^ O s S S O O r-* s O vO ¦a « CO m PsI u-i rH o^-* Cw «n + i + ' + • + • + i + 1 + i + 1 Q) 3 >v—-O O s S O O O O O O tÛ-r* r- r-t so r* o> rH e i. > PM r- (N CNJ *tf vo vO en Hl^tJ TJ C .^ O -H O C) a. «m ai U s a » ¦o r» 0\ CO L-I VO ITt r-l O rH r-» rH rH C a> -- O O O O O O >m-i I o ¦ + • + 1 I + » + 1 + 1 + 1 B g m O I ' s VO -* rH i-» W ^J- *J CO TJ 4-> rH a> a> U U jO J3 E E O O C C CX < O a 0 i-I a C/) 4-> O a o a o CC ir> È rH o U < è 3 OC (Ai u W U) U) 3 < H H H P- OQ W 03 oa o> ex (N 5,(0 0) 0) 0 eu e co Q) •o S H •o k i-I Xl S Ij C O I O) H S M sr O c Q) CO O 3 •ri M ItIlO U a O Q) co x> h < 0. U CO «0 ac o Q) » C Q) 0) .co Ci a) U 0) ¦H Xl 1-1 g 2 g 0) 2 0)^^. CC « Q) 3 O. •0) Q) 0) m Q) « i-i a1 4-> a •0) Sm X) 3 'U) U 3 0) 4-> C K 0) C Q) _3 .ri O C 0) Q) 0) O t£ i-i Q) X)X! o P .ri ¦H C •o r-l w CX 1-1 X) Q) TJ 4-> 1-1 0) O P O JJ CO a; § l-> CO m -ri o C m i-l C C 3 P Q) CO O Q) 3 Q) •a CO CO i-l H i") C an a •o Q) •o 3 0) C O i-i i-i M CC E (X ¦ri 0) CO Q) 1-1 i-i e § C 0) CO U i-I CO O i-i e Q) P Q) IO Q) E i-i O •H 0) Q) C C Hin P ca 3 O Xl 3 •H P Q) 3 » 0) .CO Q) X) CO 0) C H •o xi 0) rH P O 0 P U O O 0) 0) Q) Xl Q) o) -o 3 S 5 U 41 U 3 O) Q) i-I O Q) CO Ih 3 CO Q) 1-1 C i-l Ü Xl o0 0) Ih co C 1-1 O iH CO •• Q) Q) •ri 3 1-1 •ri -H O 3E >Q) >Q) o) m X> X) P X) CO rH r-t m - 3 3 Q H 3 3 3 (D^-S t-l tn O" 0) Q) 0) < Q) 0) a CX >^?3 M 0 i-> Q) XJ o o i-i 3 «o 4-1 •o C Xl H ¦H Q) O O •O o- C i-I s COXI -rl>Q> CO P O CJ • 4J P CO -J 1-1 CO g % U CO $ a .-i C O S s a£ 4-1 ^ CO a ifl U .CO i-I X >. O 0) "c CO 0 4J CO IO 0) Q) 0) O) 0) CC 0) U Q) 4-> 00 O U S) C 0) C *$ VD *Q) c ¦ri Q) Q) O) C O) C H 0) ¦H i-i P 4-> 4-)(¾ 4J C i-I -H Q) Q) Q) O O i-I •H ¦H -H -H O O T1 3 > O1ItI I J CO H CO H IO Q) HX) CO M 4J M E 'Q) 1-1 Q) o) c n 4-1 P 4-> P 4-> 4-1 0) 4-1 P 0) C Q) * Q) CO i-I O) 0) en 0) 0) O 0) O) 0) 0) X) 00 i-l O CO Q) Q) Q) Q) Q) -H 52 Q) Q) -ri LTl rH "O) > i-l r-l r-l ¦H iH 4-1 r-l Sil I e o Cl)w 0) i-l r-l 1-4 1-1 r-l O 1-4 H Ih l« Ih ¦H Ih r-l Ih Ih < 4-> Q) O 4J O XIi-I O C C 4-1 Q) «-> CO 0) 8 O ¦ri rH Cr-I Q) O a CC •H 8833 ¦H a CO «S O > Q) -H iJ CO co e a a 4JPO M s 0 0 #*^ •H O) O.P E 3 O o rH CO 05 fi H Q) Q) Q) U U 3 < U U H-OJ ¦H H H CQ co m CD H H m H 59 Lots comparés Comparaison des pourcentages de pontes différence significative à P^5 % Comparaison des rendements Ro : t TE-B TEAR - Surn.Spio TEAR - BAR BAR - B.Sum.Spio BAR - Surn.Spio B - Surn.Spio B-B Surn.Spio Sum.Spio-B .Surn.Spio B-TE Cop BAR - TE Cop AR oui ( P = OxJ) 7„) oui (P <0J_1 7„) oui (P = 3_,_5 %) oui (P = IxI %) non (P = 6,3 7.) non (P = 22 %) non (P = 5,9 7„) non (P = 44 %) non (P = 12 %) oui (P = IxI %) 0,75 0,22 0,67 1.19 0,69 0,31 0,78 Tableau 17 : Traitement de femelles vierges par diverses --------- combinaisons obtenues à partir de 2 types de stimulation (mécanique et chimique) : comparaison par le test de probabilité exacte de FISHER (alternative simple) des pourcentages de femelles pondant et des rendements par le test t de STUDENT. Pour le test de FISHER1 les probabilités infé- rieures à 5 % (soulignées) correspondent à une différence significative des deux lots comparés. Les rendements moyens (Rt) ne diffèrent pas significativement les uns des autres. La signification des abréviations est donnée dans la légende du tableau 16. 60 3.3.3. Durée de la préoviposition Pour les deux expériences ci-dessus, la durée de la préovipo- sition est pratiquement identique dans les différents lots, que l'on considère les témoins ayant copule, les femelles stimulées soit mécaniquement soit chimiquement, ou les deux à la fois. Cette durée est de 9 à 22 jours. Signalons encore que les billes d'acier sont expulsées par les femelles dans les jours qui précèdent la ponte ou à son début. 3.4. EFFETS GONADOTROPES LIES A L'IMPLANTATION DE "CERVEAUX" 3.4.1. Brovats de "cerveaux" L'injection de broyats de "cerveaux" non centrifugés a provoqué la mort, après 4 à 5 jours, de la majorité des femelles traitées. Les quelques survivantes n'ont montré aucune vitellogé- nèse lors de la dissection. L'expérience a été répétée en centrifugeant l'homogénat et en injectant le surnageant à différentes dilutions (1/1; 1/5; 1/10; 1/50). Les tiques donneuses s'étaient gorgées une semaine aupara- vant. Elles étaient soit vierges, soit elles avaient copule. Dans cette expérience, la survie des femelles a été totale, mais la dissection n'a montré pratiquement aucune vitellogénèse. L'homogénéisation des "cerveaux" a été alors abandonnée au profit d'expériences de transplantation. 3.4.2. Transplantations de "cerveaux" Pour savoir si l'implantation de "cerveaux" pouvait stimuler la vitellogénèse et la ponte, nous avons fait une série d'expérien- ces avec des tiques donneuses d'état physiologique différent. Equivalent de 1 "cerveau" par femelle. Provenance : - femelles vierges à jeun - femelles vierges et nourries depuis 7 jours - femelles ayant copule et nourries depuis 7 jours. 61 3.4.2.1. Donneuses nourries depuis 2 jours et ayant cogulé Les "cerveaux" prélevés ont été implantés sur des femelles vierges nourries depuis 100 jours. Lors d'une expérience pré- liminaire, aucune femelle n'avait pondu dans un délai de un mois suivant l'opération. Cependant, à la dissection, beaucoup d'individus présentaient des traces très nettes de vitellus en voie de résorption. De ce fait, les dissections lors des expériences suivantes ont été réalisées 14 jours après l'opéra- tion. Nous avons déterminé le pourcentage de femelles "positi- ves" par l'examen des ovaires (critères selon 2.4.3). Les résultats sont consignés au tableau 18. On constate tout d'abord que le traumatisme opératoire ne semble pas avoir eu d'influence sur la vitellogénèse. Par contre, les femelles ayant subi la transplantation ont réagi au stimulus : 56 X d'entre elles ont présenté des ovocytes bruns à la dissection. Le test de FISHER nous indique une différence hautement signi- ficative entre les témoins opérés et les femelles ayant reçu un "cerveau" (P = 0,2 X). Dans ce cas, la transplantation a donc eu une action stimulante sur la vitellogénèse. Cependant, la majorité des ovaires ont présenté une vitellogénèse de type Traitement subi Nombre de 2? traitées Nombre de î? positives (selon 2.4.3) X de SS positives Aucune opération Opération "blanche" Transplantation de "cerveaux" 18 18 32 2 2 18 11 11 56 Tableau 18 : Effet de la transplantation de "cerveaux" de femelles nourries depuis 2 jours et ayant copule, à des femelles vierges nourries depuis 100 jours. 62 abortif, c'est-à-dire semblable à celle observée chez des fe- melles vierges et nourries, par AESCHLIMANN (1968) et GERMOND & AESCHLIMANN (1977) . Dans notre expérience, nous avons re- marqué l'amorce de la résorption du vitellus car la dissection .2) a ete faite relativement tot . En outre, aucune tique traitée n'a pondu dans le délai de 14 jours séparant l'opération de la dissection. On peut donc conclure que des "cerveaux" de femelles ayant copule et nourries depuis 2 jours peuvent avoir une faible action gonadotrope s'ils sont transplantés à des individus vier- ges et nourris depuis 100 jours. 3.4.2.2. Donneuses dans différents états^physiologiques D'autres expériences de transplantation ont été réalisées avec des "cerveaux" provenant de femelles vierges.de femelles ayant copule ou de mâles à différents stades physiologiques. Les femelles receveuses (vierges et gorgées depuis 100 jours) ont été disséquées 14 jours après l'opération et l'ovaire examiné. Les résultats sont consignés dans le tableau 19. A la dissection, tous les lots présentaient un taux élevé de femelles en vitello- génèse (38 à 52 %), excepté les deux lots témoins (10 et 11 %). L'état physiologique du donneur (nombre de jours après le repas sanguin, sexe, virginité) ne semble pas influencer significati - vement la réponse observée (test de FISHER, P^ 5 X). De plus, le test de FISHER montre que la réponse de chacun des lots diffère de façon significative (P=s5 %) par rapport à celle des témoins. Il indique également que le traumatisme opératoire n'a pas d'influence sur la vitellogénèse. Dans cette expérience, toutes les vitellogénèses observées étaient de type abortif. Le diamètre des plus grands ovocytes ne dépassait pas 600 um et aucune ovulation n'a été observée. Cet état est caractérisé par des ovocytes de formes irrégulières, au vitellus "liquéfié" (Planche I, fig. 3; AESCHLIMANN, 1968). La désagrégation des granules vitellins commence à la périphérie de 1'ovocyte. 63 co o>% Of .H O r-l O ini rsl 00 in VO OO CO O CN O CN 4J rH r-l in i-i 1-1 1-4 i-i 1-1 1-1 l-l i-i l-l O) -H C U 4J O .O -r4 r-l E 05 O) O 0 co Z Q.W Of Of 0 •a « (D (D'(D O Ov vO I I Of ¦-I Ot Sn O Of CO o •o ..-< C O C C C XJ •H O O O 3 U ¦1-1 .1-4 •ri ra (0 IH 4-1 CO 4-1 CO U CO 4-> '(D 4-) t i i I 4-) i i i I 4-) I C a C = C C C (D O O (D (0 - : r : CO : : s : CO Ï e ¦r4£ 1-1 i-l l-l 0) (D 4-> O a i t l i a l i i l a I 4J C (0 C (0 CO co ..-4 -i S-I (0 C C C (0 O '(D i-i (0 co co S-I 3 co S-I S-I S-I H < O = H H H ni 4-1 '(D 07 4J C (I! S-I 'CD CH co Ch S-I i-i 3 T) O •i-i CO CO Ct)O •Or-I CO co S-I ¦H 3 3 Ol a C CIl CO O T) co Ol CD ¦i-l T) U H r 3 X O 3 C CO O) co > O) S-i Wl O) S-I U O) ¦H > Ol T) CO O) C l-l O r-l ¦r4 (I) 4J b co O) 4J (4-4 C co co l-l O) O, -O co C cfl co S-I co 4-1 O) 3 Ct) rr r-4 ¦H 01) (D O TJi-I O 4-1 ¦r-l Ol CO Cm >, Ch j3 W U 3 CO (D r-l JO, CO En résumé, l'implantation d'un "cerveau" induit une vitellogé- nèse, laquelle est abortive, quels que soient le sexe et l'état physiologique de la tique donneuse. 3.4.2.3. Transplantation de "cerveaux" avec ou sans comglexe endocrine rétrocérébral Un complexe endocrine rétrocérébral a été décrit chez les Argasides (GABE, 1955 ; ROSHDY & al, 1973). Sa présence a été confirmée chez 0. moubata (EICHENBERGER, 1970). Cet organe est situé près de l'oesophage, dorsalement par rapport au "cerveau". Il possède une structure voisine de celle des corpora cardiaca chez les insectes et des organes de SCHNEIDER chez les arai- gnées. Dans les expériences précédentes, nous avions transplanté chaque "cerveau" en prenant bien soin d'éliminer, au préalable, le fragment d'oesophage qui le traverse. Les expériences suivan- tes ont eu pour but de tester une éventuelle différence d'acti- vité entre "cerveaux" accompagnés ou privés de leur complexe endocrine. Pour chaque stade nutrìtionnel (femelles à jeun, gorgées depuis 0, 3 ou 7 jours), des femelles vierges ou des femelles ayant copule ont été utilisées comme donneuses de "cerveaux", avec ou sans leur complexe rétrocérébral. Des mâles (à jeun ou gorgés depuis 5 jours) ont également servi de donneurs de "cerveaux" avec ou sans leur complexe rétrocérébral. Les résultats sont donnés dans le tableau 20. Après 14 jours, la dissection des femelles traitées a montré un taux élevé de vitellogénèses (44 à 82 % des ovaires) par rapport au lot témoin où les femelles avaient subi l'opération sans recevoir de "cerveau" (8 % d'ovaires en vitellogénèse). L'analyse statistique par le test de FISHER confirme que ces différences sont significatives à P*5 5 %. Pour le lot où nous avions transplanté des "cerveaux" de femelles à jeun ayant copule, munis de leur complexe rétrocérébral, la différence est significative à P<8,1 %. 65 Traitement subi Etat physiologique des donneurs Nombre de SS traitées Nombre de SS positives (selon 2.4.3) % de SS positives Opération "blanche" Opération "blanche" suivie de copulation - ... ... 12 7 1 6 8 86 Tranplantation nspiantes xe vierges à jeun nourries depuis O"jours nourries depuis 3 jours nourries depuis 7 jours 10 10 11 9 7 5 7 7 70 50 64 78 Tranplantation rveaux" tra s. le compie rocôrébral 99 ayant copule à jeun nourries depuis 0"jours nourries depuis 3 jours nourries depuis 7 jours 10 10 11 10 7 5 9 5 70 50 82 50 Transplantation O £1 4-1 O COPD ââ à jeun nourris depuis 5 jours 10 10 5 6 50 60 Tranplantation iti JJ C CO ax en C 29 vierges à jeun nourries depuis O'jours nourries depuis 3 jours nourries depuis 7 jours 9 10 9 10 6 5 5 5 67 50 56 50 Transplantation Ij g U U O JD : U'QJ X S-. 3 Qj 'QJ û; O > Ul Vj Lj ali-» (U >PQJ u calti 99 ayant copule à jeun nourries depuis 0"jours nourries depuis 3 jours nourries depuis 7 jours 9 9 11 9 4 6 7 5 44 67 64 56 Transplantation â<5 à jeun nourris depuis 5 jours 10 9 5 5 50 56 Tableau 20 : Effets comparés de la transplantation de "cerveaux" avec ou sans complexe rétrocérébral, de donneurs dans différents états physiologiques à des femelles vierges nourries depuis 100 jours. "La transplantation a lieu dans les deux heures suivant le repas sanguin, 66 Les femelles ayant subi une opération "blanche" et ayant ensuite copule montraient des ovocytes lourdement chargés de vitellus dans 86 "L des cas (6 sur 7 femelles). Beaucoup d'oeufs étaient visibles dans la lumière de l'ovaire, des oviductes et de l'uté- rus. La majorité des femelles avait d'ailleurs déjà commencé à pondre le jour de la dissection (14e jour). En revanche, les vitellogénèses des animaux traités étaient toutes de type abortif et aucune ponte n'a été observée. Les résultats de l'expérience montrent de grandes fluctuations entre les réponses de chaque lot. Nous ne pouvons donc mettre en évidence un effet quelconque sur la vitellogénèse, dû à la présence du complexe rétrocérébral. Les différences observées entre deux lots correspondants (avec ou sans complexe endocrine) ne sont jamais statistiquement signifi- catives (test de FISHER, P^> 5 X). Selon toute vraisemblance, elles proviennent d'un phénomène purement aléatoire. En conclusion, un seul fait demeure certain s les "cerveaux" transplantés induisent la vitellogénèse abortive, quel que soit leur stade physiologique. Signalons encore que lors de la dissection, deux semaines après la transplantation, les "cerveaux" ont été retrouvés apparemment intacts dans l'hémocoele des femelles réceptrices. N'ayant pas fait l'histologie de ces organes, nous ne savons toutefois pas si des modifications structurales se sont produites durant ces 15 jours. 3.5. ACTION DES HORMONES JUVENILES SUR LA VITELLOGENESE ET LA PONTE 3.5.1. Injection et application externe : comparaison des méthodes Le mode d'application de l'hormone pouvant jouer un rôle très important dans la réponse attendue, nous avons tout d'abord testé deux méthodes i l'injection dans l'hémocoele d'une solu- tion huileuse et l'application externe sur la face ventrale d une solution acétonique (voir 2.5.). Nous avons constitué 67 neuf lots de femelles vierges et nourries depuis 100 jours. Les témoins ont reçu le solvant pur par injection (INJ TE) ou par application externe (TOP TE). Les autres lots ont été traités par un mélange à parts égales de JH-I et JH-III de concentra- tion croissante, soit par injection, soit par application externe. Lors de la dissection (25 jours après le traitement), une partie des femelles avait pondu. Quelques autres montraient une vitel- logénèse avancée, avec des oeufs dans la lumière de l'ovaire, de l'oviducte et de l'utérus ^(Tableau 21). Globalement, il apparaît que l'injection a donné de meilleurs résultats que l'application externe. Statistiquement (Tableau 22), seule la dose de 50 Mg injectée a fourni une stimulation significative- ment différente de celle des témoins correspondants. L'intensi- té de cette stimulation n'est pas statistiquement différente de celle provoquée par la copulation. Nous avons observé 58 % de réponses positives chez les tiques ayant reçu 500 yug d'hormone en application externe. Toutefois, en raison du faible nombre de femelles utilisées dans cette expérience et dans les lots témoins, aucune différence significative n'a pu être décelée entre ce résultat et les pourcentages observés chez les témoins ayant copule ou non (Tableau 22). Un pourcen- tage identique (58 %) de femelles positives a été obtenu après injection de 50 ^Ag de mélange JH-I - JH-III . L'injection de 500yug d'hormone par femelle a provoqué la mort dans les 3 à 5 jours; cette dose est donc létale. L'application externe ou l'injection d'hormones juvéniles (JH-I et JH-III) peut donc induire la vitellogénèse et la ponte chez les femelles vierges et nourries depuis 3 mois. Des expériences préliminaires avaient montré que l'hormone juvénile induisait des pontes plus tardives que la copula- tion; ainsi, après 25 jours, quelques femelles encore étaient positives (vitellogénèse selon 2.4.3) sans avoir pondu. Leur vitellus ne montrant pas de signes de résorption, nous avons pensé que la ponte aurait pu avoir lieu. Dans nos tableaux, nous avons donc choisi de décrire le pourcen- tage d'ovaires présentant une vitellogénèse, et non le pour- centage des pontes. 68 Lot nombre nombre de 99 positives total de îî % de 99 positives TE Cop 9/11 82 TOP TE 2/10 20 TOP 1 5/15 33 TOP 50 4/15 27 TOP 500 7/12 58 INJ TE 2/12 17 INJ 1 3/11 27 INJ 50 7/12 58 INJ 500 Toutes les 9 9 sont mortes (14/14) Tableau 21 ! Traitement de femelles vierges et nourries depuis ¦---------------- 100 jours par un mélange à parts égales de JH-I et JH-III (stéréoisomères Fluka). Les hormones sont soit déposées sur le corps de l'animal, soit injectées. La dissection, 25 jours après le traitement, permet de comptabiliser les femelles positives (signes nets de vitellogénèse dans l'ovaire, selon 2.4.3). : femelles témoins ayant reçu une appli- cation externe d'acétone pure : femelles ayant reçu une application externe de 1 jjg de mélange d'hormones en solution acétonique : idem TOP 1, avec 50 yg de mélange : idem TOP 1, avec 500 yg de mélange : femelles témoins ayant reçu une injection d'huile d'olive pure INJ 1 : femelles ayant reçu une injection de 1 yg de mélange d'hormones en solution dans l'huile d'olive INJ 50 ! idem INJ 1, avec 50 jjg de mélange INJ 5O0 s idem INJ 1, avec 500 yg de mélange TE Cop : femelles témoins ayant copule TOP TE TOP 1 TOP 50 TOP 500 INJ TE 69 Lots comparés Différence significative à P 45 ï TOP TE - TOP 1 non (P = 39,9 7.) TOP TE - TOP 50 non (P = 54,5 7.) TOP TE - TOP 500 non (P = 8,2 7.) INJ TE - INJ 1 non (P = 45,5 7.) INJ TE - INJ 50 oui (P = 4J5 %) TOP TE - TE Cop oui (P = OjZ X) TOP 1 - TE Cop oui (P = 1_J) 7.) TOP 50 - TE Cop oui (P = OJi 7o) TOP 500 - TE Cop non (P = 22,2 7.) INJ TE - TE Cop oui (P = OJi %) INJ 1 - TE Cop oui (P = Ui %) INJ 50 - TE Cop non (P = 22,2 7.) Tableau 22 : Comparaisons statistiques par le test de probabilité exacte de FISHER (alternative simple) des réponses enregistrées après traitement aux hormones juvéniles de femelles vierges et nourries depuis 100 jours (données du tableau 21). Les probabilités inférieures à 5 % (soulignées) correspondent à une diffé- rence significative des deux lots comparés. Toutefois, seul l'effet de l'injection du mélange a été sta- tistiquement démontré. Aussi, par la suite, seules les injections d'hormones juvéniles ont été utilisées. 3.5.2. Détermination de la dose optimale effective en injection Nous avons tenté d'estimer quelle était la dose optimale d'un mélange de différents stéréoisomères de JH-I et JH-III 70 (proportion 1:1) agissant sur la vitellogénèse et la ponte de 0. moubata. Nous avons constitué 7 lots, dont 4 de témoins (vierges ou non, injectés avec de l'huile d'olive ou non). Les 3 lots restants ont reçu le mélange d'hormone à différentes concentrations (15, 20 et 150 yUg par femelle). Le tableau 23 résume les résultats obtenus. A la dissection, 40 à 60 % des femelles traitées aux hormones juvéniles ont montré une vitellogénèse bien marquée (selon 2.4.3.). Seulement 7 à 13 % des témoins vierges ont présenté une réponse positive, alors que tous les témoins ayant copule ont pondu. Statistiquement, les témoins vierges se distinguent de façon significative des lots traités avec 15 et 50 /u% d'hormone (Tableau 24; P égal resp. à 0,9 et 0,6 %) . Par contre, la dose de 150 /ig est moins stimulante (différence non significative par rapport aux témoins vierges : P = 7,5 %). Le test de FISHER ne nous permet pas de savoir laquelle des trois doses utilisées est vraiment la plus efficace. Les variations (40 à 60 % de réponses positives) sont peut-être aléatoires. Toutefois, les plus forts pourcentages de réponses positives observés n'atteignent pas ceux obtenus après une copulation mais n'en sont pas statistiquement différents (Tableau 24). Un test de la médiane nous indique que le nombre moyen d'oeufs pondus est comparable chez les femelles traitées aux hormones et chez les témoins ayant copule (Tableau 25). D'autre part, les pontes ont été plus tardives chez les tiques traitées (17 à 23 jours) que chez les individus ayant copule (8 à 17 jours). Le retard moyen est d'environ 8 jours. 3.5.3. Distinction entre stimulus de JH-I et stimulus de JH-III Ayant établi qu'un mélange de stéréoisomères des deux hormones juvéniles (JH-I et JH-III; proportion lsl) induisait la vitellogénèse et la ponte chez 0¦ moubata. nous avons alors testé séparément JH-I et JH-III afin de voir si les tiques 71 Lot nombre de ?? positives nombre total de 9? % de 9Ï positives TE Cop + INJ 7/8 88 TE Cop 13/13 100 TE 2/15 13 INJ TE 1/14 7 INJ 15 6/10 60 INJ 50 9/16 56 INJ 150 4/10 40 Tableau 23 : Injection d'un mélange à parts égales de JH-I et -------------------- JH-III (stéréoisomères Fluka) en solution dans l'huile d'olive à des femelles vierges et nour- ries depuis 100 jours. La dissection, 25 jours après le traitement, fermet de comptabiliser les femelles positives signes nets de vitellogënèse dans l'ovaire, selon 2.4.3). TE : femelles témoins n'ayant subi aucun traitement : femelles témoins ayant reçu une injection d'huile d'olive pure : femelles ayant reçu une injec- tion de 15 yg, de mélange d'hor- mones en solution dans l'huile d'olive : idem INJ 15, avec 50 jjg, de mélange ! idem INJ 15, avec 150 ug de mélange : femelles témoins ayant copule et reçu une injection d'huile d'olive pure : femelles témoins ayant copule INJ TE INJ 15 INJ 50 INJ 150 TE Cop + INJ TE Cop 72 Lots compares Différence significative à P «£5 7. INJ TE - INJ 15 oui (P = 0.9 7.) INJ TE - INJ 50 oui ( P = 0^6. 7.) INJ TE - INJ 150 non (P = 7,5 7.) INJ TE - TE Cop + INJ oui (P = 0.04 7.) INJ 15 - TE Cop + INJ non (P = 22,5 7.) INJ 50 - TE Cop + INJ non (P = 14,2 7.) INJ 150 - TE Cop + INJ non (P = 5,7 7.) Tableau 24 : Comparaisons statistiques par le test de probabilité exacte de FISHER (alternative simple) des réponses enregistrées après injection d'hormones juvéniles à des femelles vierges et nourries depuis 100 jours (données du tableau 23). Les probabilités inférieures à 5 % (soulignées) correspondent à une différence significative des deux lots comparés. Lots Nombre de 9? Nombre moyen Test de la médiane ayant pondu d'oeufs par 9 P % TE Cop + INJ INJ 15 INJ 50 INJ 150 '} 7 17 Tableau 25 : Comparaisons statistiques par le test de la médiane du nombre moyen d'oeufs pondus par des femelles vierges et nourries depuis 100 jours, après injection d'hormones juvéniles JH-I et JH-III. (Pour abréviations voir tableau 23), La différence enregistrée n'est pas significative (P>5%). ^ réagissaient mieux à l'un des deux stimuli. Pour ce faire, nous avons utilisé 7 lots différents. Deux lots ont reçu JH-I (25 et 75/ig par femelle), deux autres JH-III (doses identiques),- un groupe a été injecté avec un mélange à parts égales des deux hor- mones. Finalement, des témoins ayant copule et d'autre pas, ont reçu de l'huile d'olive pure. Dix tiques par lot, prises au ha- sard, ont été disséquées 10 jours après le traitement. Mis à part les femelles témoins ayant copule, la vitellogénèse, lors- qu'elle se présentait, se trouvait chez presque tous les indivi- dus à un stade très précoce (Tableau 26). Le test de FISHER montre une différence significative entre chacun des lots et les femelles témoins ayant copule (P varie entre 0,1 et 2,9 %) . Les hormones juvéniles (mélange de stéréoisomères) induisent donc la vitellogénèse à un rythme beaucoup plus lent que ne le fait la copulation. Le reste des femelles a été disséqué au 25e jour (Tableau 26). L'injection d'hormones a provoqué une vitellogénèse chez 18 à 50 % des individus, selon les lots. La réponse la plus forte a été obtenue avec 75 /Ug de JH-I. Ving-cinq >ig de JH-I ou de JH-III semblent insuffisants pour obtenir une réaction statis- tiquement différente de celle des témoins vierges (Tableau 27). Par contre, les doses de 50 et 75 f«g de JH-I ou JH-III induisent une réponse différant de manière significative de celle des témoins vierges. Dans cette expérience, 88 % des témoins ayant copule ont montré une vitellogénèse. Ce pourcentage est nettement supérieur aux proportions enregistrées dans les autres lots (Tableau 26). La copulation est donc un stimulant plus efficace qu'un traitement aux hormones juvéniles, du moins, avec les doses appliquées ici. Nous n'avons pu mettre en évidence une différence nette d'activité entre JH-I et JH-III. Les deux hormones ont provoqué des vitellogénèses dans des proportions sensiblement identi- ques, à doses comparables. Contrairement à l'expérience précédente, le nombre moyen d'oeufs pondus par femelle est ici bien inférieur chez les tiques traitées aux hormones que chez les individus ayant copule (Tableau 28). 74 (O O) CO Of > Ci Of .H 3 P co a oo O oo O O r» oo 00 H IO N PI N (D -H AD "O TJ O] U O cxm ^S a (OrJ oo C (Din O >(N r-l S-* 0 H 0 - ClOf P (0 0) CO in o co oo ci r^ in X) Of ,-I ADw ¦ S co Ci -tf i-i O (D O O. • • Z-O aio-oiN (0 <$ a 3 Ci 4) O" 3 Ci Of <, 0 >- 0, Z (0 0 O rH (0 (0 O) . >•¦-) 0 H Tl P O '¦n »(ri 0 (D CM HObO • ON rH rH CO Pi n r, g - P C san ion r" H H co I 0 a p O CO 0 H 3 » 0 -H 0 H 0 H .(O T) Ci Ci P 3 > O 18 H Xi H CO C 0 0 (0 H 0 0OH Ci C TJ O C C H co C P 0 • 0 H rt 2 .H C TJ r-l H Xi O P 5£ O IH H VD - »0 q; H 0 I I e h Cl •rH P H X X VD co (0 (S O H H) ?"I C co P 0 CO 60 «g 0 •>-) B 0 0 P S w Cl a C TJ T) TJ TJ 0 CO C H TJ HH 3 OO oo 00 C M > GO Ï C i, a» a.o M Cl P C O H I (0 3 ci 3 H in m in 3 X 0 O (0 P (N (N IH •r-,p 3 O H rH C O" 0 0 0 0 0 O tal O 0 0 1-) TJ TJ C TJ co rH CO Cl C 0 O 0 ¦0 ¦H C C C g S c rHU-i co Ci P 0 O O O 0 VD a. 0 0 H E H O H X co 3 C P P Xl P H •I 0 ¦o CT CO VD 0 VD H 3 O 0 O O 0 5 •b O M 0 H CO COH 3 3 1-> » H-) H •O I 0.(0 CO H CX O- C TI CH OO C X rH ¦ÖS 3 8 O O H H OO H O X H H) 0 0 a, 0 TJ in 0 P VD H VD Ih - P P C C r- C 0 >rH P co C S 3 in 3 0 3 3 O VD CO 8 (O 0 r- H O H H-). PH S >% 3 > 3 H 5 3 ' X) O) (O (O O H O OO OX CO C H © H 9? fi X! CO 0 H, 0 0 O - H co co Cl 0 > » Ci CrH TJ H C C (O H » 0 OH CO UX) H H P TJ P m P T) HB 3 (O TJ P IO P O B S O e C (O 0 in § CO C (N (3 CO O- H CX VD VD SrH (N S(O H S 0 .CrH > co E P 3 p (O H (O T) H (O H H 3 O a 3 IH H (O TJ OO TJH O CO O) CO r. I O) C I co OO C e a 0 2 0 0 X 0 O X 0 •© C (0 H .0 H H H H H) H •ri H) H 0 13 O) P H H H H H P H O) •ri 4-> C o ci M3 VD I H O 8 I CO C 0 8 3 H e 0 8£ O O • P 0 0 0 (O T) 0 O TJ 0 (O 0 vi (0 -••-) C Ch T) ih Ih T) H Ch co H Ih a •r-,p Cl P O C 3 3 om -• •• « — •- •• — HiH H H 0 -O-O co •-> (H CO 0 0 AD Z 0 C 8 3TJ O-H .§ H m in T) OH co a DO + (N r- £ (D O m m CO^-N co O H e- W (N r~« H H S P (0 H 0 H O H H IH 0 M 3 ClH 0 O M H H H Ch 3 a 3 P •n I i I I H (H rH 0 O P ¦H W Z X X X X 0 W U. TJ (Xi 0 > H H H) H) H) H) z: 3 « H X) (O H 75 Lots comparés Différence significative à P <, 5 7. INJ TE - JH-I 25 non (P = 11,4 %) INJ TE - JH-I 75 oui (P = O1J1 %) INJ TE - JH-III 25 non (P = 9,2 %) INJ TE - JH-III 75 oui (P = O1^ %) INJ TE - MEL 50 oui (P = 2^ %) INJ TE - TE Cop + INJ oui (P = OxO %) JH-I 25 - TE Cop + INJ oui (P = O1O %) JH-I 75 - TE Cop + INJ oui (P = IjX %) JH-III 25 - TE Cop + INJ oui (P = 0^0 %) JH-III 75 - TE Cop + INJ oui (P = O1I 7.) MEL 50 - TE Cop + INJ oui (P = 0,0 %) Tableau 27 i Comparaisons statistiques par le test de probabilité exacte de FISHER (alternative simple) des réponses enregistrées après injection d'hormones juvéniles à des femelles vierges et nourries depuis 100 jours. (Données du tableau 26). Les probabilités inférieures à 5 % (soulignées) correspondent à une différence significative des deux lots comparés. 76 Lots Nombre de ?? ayant pondu Nombre moyen d'oeufs par 9 Test de la médiane P 7. TE Cop + INJ JH-I 25 I JH-I 75 JH-III25/JH-III75 MEL 50 0 15 24 78 t 23 51 - 19 Tableau 28 : Comparaisons statistiques par le test de la médiane du nombre moyen d'oeufs pondus par des femelles vierges et nourries depuis ICO jours, après injection d'hormones juvéniles JH-I et JH-III. (Pour les abréviations, voir tableau 26), La différence enregistrée est significative (P <5 %). La différence apparaît comme hautement significative. Cette expérience nous permet donc de supposer que la copulation est un stimulant plus puissant que l'injection d'hormones juvéniles (mélange de stéréoisomères), aussi bien dans le cas du pourcen- tage d'individus positifs que dans celui du nombre d'oeufs pon- dus par animal. Ce résultat ne contredit pas les considérations énoncées sous 3.5.1. et 3.5.2. En effet, les faibles différences enregistrées alors ne permettaient pas d'exclure l'éventualité que les deux types de stimuli provoquent des réponses non iden- tiques. Cette éventualité semble se confirmer ici. Le retard du délai de ponte s'est manifesté également dans ce cas. Les femelles traitées aux hormones ont pondu entre le 17e et le 24e jour, alors que les témoins ayant copule l'ont fait entre le 7e et le 14e jour. Le retard moyen est donc d'environ 10 jours. 77 3.5.A. Injection d'isomères naturels de JH-I. JH-II et JH-III Les hormones correspondant aux stéréoisomères naturels des insectes ont également été utilisées. JH-I, JH-II et JH-III ont été injectées à 4 doses différentes (O1Ij 1; 10| 100 /tg/9) à des femelles vierges et nourries depuis 100 jours. Au cours des 25 jours suivant le traitement, toutes les femelles ayant copule (témoins) ont pondu, plus précisément entre le lie et le 20e jour. Durant ce même laps de temps, seuls 9 individus traités ont déposé des oeufs (entre le 16e et le 23e jour). Le plus fort pourcentage de pontes a été obtenu après injection de 100 jug par femelle de l'hormone JH-II (Tableau 29). Cette réponse est la seule à se distinguer statistiquement de celle des témoins vierges (P = 1,7 % pour le pourcentage de femelles en vitellogénèse et P = 4,2 % pour celui des tiques ayant pondu). Les quelques pontes enregistrées dans d'autres lots, notamment chez les femelles ayant reçu 100 yg de JH-III, ne permettent aucune conclusion, statistiquement parlant. D'autre part, sur 17 femelles positives recensées chez les tiques traitées, seules 9 ont pondu, soit à peine plus de la moitié. Les hormones utilisées exercent donc souvent un stimulus in- complet s la vitellogénèse est abortive ou tellement ralentie que la ponte n'intervient que très tardivement. Signalons encore que tous les lots se distinguent statistiquement des témoins ayant copule (P^ 5 %) . L'injection d'hormones juvéniles isomériquement semblables à celles des insectes n'exerce pas ou peu d'action gonadotrope alors que le mélange de stéréoisomères donne des résultats nettement meilleurs. 78 Prodult injecté Doses en yug Nombre de 99 traitées Nombre de 99 positives selon 2.4.3. Nombre de 99 ayant pondu 7. de 99 positives selon 2.4.3. Huile d'olive pure ** 14 15 14 0 14 0 100 0 JH-I 0,1 1 10 100 14 14 14 14 2 1 1 1 1 1 0 0 14 7 7 7 JH-II 0.1 1 10 100 14 14 13 14 1 1 1 5 0 0 1 4 7 7 8 36 JH-III 0,1 1 10 100 12 13 14 14 0 0 1 3 0 0 0 2 0 0 7 21 Tableau 29 : Effets de l'injection d'hormones juvéniles JH-I, JH-II et JH-III (isomères naturels des insectes •• ECO Chem. Interni) en solution dans l'huile d'olive, à des femelles vierges et nourries depuis 100 jours. Les tiques dont l'ovaire présentait des signes nets de vitellogénèse a la dissection (selon 2.4.3.), 25 jours après le traitement, sont considérées comme positives. Lot de femelles témoins ayant copule Lot de femelles témoins vierges 79 3.6. ACTION DES "PRECOCENE" SUR LA VITELLOGENESE ET LA PONTE Les "Precocene 1 et 2", substances antiallatotropes chez certains insectes, ont été appliqués à 4 doses différentes (0,1; li 1Oi 100 ^/cit ) sur du papier filtre, au contact duquel nous avons placé des femelles. Ce traitement a été effectué avant et après, ou seulement après le repas sanguin. A part les témoins vierges, toutes les tiques ont copule après s'être nourries. Chaque individu a été pesé le jour précédant et le jour suivant le repas . Les résultats, consignés au Tableau 30, montrent tout d'abord 2 que les 3 doses les plus faibles (0,1s 1 et 10 f&lcm ) n'ont eu d'influence ni sur la quantité de sang prélevé, ni sur le pour- centage de femelles ayant pondu, ni sur la durée moyenne de — 2) preoviposition, ni encore sur le rendement de la ponte R, Cette constatation est valable aussi bien pour le "Precocene 1" que pour le "Precocene 2". Une dose de 100 /«g/cm de "Precocene 1", appliquée durant les 3 jours précédant le repas sanguin, a empêché les femelles de se nourrir (Tableau 30 A). Celles-ci ont même perdu du poids entre les deux pesées. Elles ont encore vécu 8 à 14 jours après la fin du traitement, mais en montrant des signes très nets d'intoxication i pattes recroquevillées, difficultés de déplacement, etc.. Le même traitement, effectué avec du "Precocene 2", n'a pas influencé de manière significative la quantité de sang ingéré par rapport aux femelles témoins (test t de STUDENT, seuil de 5 7-). Par contre, ce traitement a diminué le pourcentage de l) 2 Un test deX , effectué sur 84 femelles non traitées, nourries depuis 1 jour et ayant copule, montre que la dis- tribution du poids n'est pas incompatible avec une distri- bution normale. Nous avons donc utilisé le test t de STUDENT (seuil de 5 %) pour comparer entre eux les poids moyens, un jour après le repas sanguin. 2) nombre d'oeufs pondus 1*2 = poids de sang ingéré ( défini sous 3.1.3.) (après concentration) 80 0,73 ï 0,11 0,70 - 0,10 0,80 - 0,09 (-< «-» A Pl 1 1 °e. t, O O O O +( +. +( +( et m oo «* r- r-. r* r* O O O O itili -^r-(N r> pi io + ¦ +• +( i i-i •» O Pl (N «» i— t-* i-( f-( »N IO f-¦* «i m « + ¦ +< +( +( ¦« w » n n «N m n Ü (n n in r-. r- eo <-i «* «n -tf + « +( +( +( » O O" ¦» H fH H N % de «9 ayant pondu avant 30 jour» SS8 : O Ot O »"~ I Nombre de 9« ayant pondu avant 30 îoura nombre total de >t 9/10 8/9 10/10 toute* les 99 sont mortes 9/9 9/10 10/10 7/10 1 11! 206,6 î 82,4 190,8 t 88,5 236,0 * 96,2 36,5 t 16,2 228,2 î 72,1 207.8 ± 55,5 228.9 î 111,1 202,8 î 1OA,3 I Polda moyen avant If repu aanajuln » 42,8 t io,6 45.4 t 15,6 46.5 t 20,0 45,4 t 15,6 45,0 - IA,5 43,7 t 11,7 46,4 t 19,7 45,6 î 15,8 I Dose B 5-a S 5-a S L I »3D003ÌU Z 3N330331U CD H H « °. t 1. -O O O O +( +• +( +( 'in r-. (A r-r» c- 00 r— Ô Ô Ô Ò « CO N (O »-( O «-* »-* O O O O +( +( +( +( O ru n CN O O O O « OD PI 4 3 -tf (N «M + . +( +( +( r» •* *sr (M l-( rH r-( •-« OO *T O Pl r-( n ^o «n + i +i +i +( io fN m pi i-» r» m ri i-( t-t t-( r* -* «o ¦* so + ( +( +( +• Oi h B O« ¦-( r-l r-i CM m •* t-< (N (N fN -ar ¦* u** ih N N H O + ( +( +( +( ^? CO 0s O (N 0s -tf C-O ""> r- n r-( r-4 r-( r-l + 1 +( +( +( 00 * N IO ri o tn n N m l/\ 4 5-sS :--3§ X 3N330D3Hd Z 3N33033Hd O f« O i +• !-• r- O m ¦* ! + > IO (N (-< ¦* : + » CT« .-( O 8 ^ O ^ 00 ^. -«* O OO ^ .H -• (N r- IO + ( + ( 00 r-< io" sO ^ ^ (N (N o o Ut' (O .-( r-4 + ( + ( ^i 00 (O* ¦» -* ¦* O e C C ¦M ¦H ïî 1.3 :w .> » 4 O 81 femelles ayant pondu ! 70 % contre 100 % chez les témoins ayant copule (Tableau 30 A, C). Cet écart n'est cependant pas signi- ficatif (test de probabilité exacte de FISHER, P ?» 5 %) . La durée moyenne de préoviposition a été sensiblement plus élevée dans ce lot (24 - 4 j,) que chez les témoins ayant copule (19 - 4 j.); cette différence est significative (test de la médiane ; P = 3,2 7.). Le rendement 57 (0,74 t 0,13) a été comparable à celui des témoins (0,71 - 0,10). Le test de la médiane nous le confirme (P> 5 %) . 2 Une dose de 100 ug/cm de "Precocene 1", appliquée après le repas sanguin uniquement et durant 11 jours, a fortement réduit le pourcentage de femelles ayant pondu (40 % contre 100 % chez les témoins ayant copule : Tableau 30 B,C). La différence est significative (test de probabilité exacte de FISHER, P = 1,2 %). La durée moyenne de préoviposition a été augmentée de façon très marquée (29 - 6 j.) dans ce lot par rapport aux témoins ayant copule (19 - 4 j.). Le test de la médiane montre que la différence est significative (P = 3,2 %). Par contre, le rende- ment R^ ne s'est pas écarté de manière significative de celui des témoins ayant copule. Le même traitement, effectué au moyen de "Precocene 2", a également diminué le pourcentage de femelles ayant pondu (67 % contre 100 % chez les témoins ayant copule). La différence n'est cependant pas significative. Par contre, les femelles de ce lot n'ont subi aucun retard dans leur rythme de ponte et le rende- ment R, s'est montré comparable à celui des témoins ayant copule. Relevons encore que la durée moyenne de préoviposition des témoins ayant copule a été très élevée (19 jours), alors qu'elle se situe habituellement entre 10 et 15 jours. Nous n'avons pu expliquer ce phénomène. Notons également que les différents rendements de ponte R, ont presque tous été supérieurs à la valeur observée chez les té- moins ayant copule. Nous ne pouvons cependant pas conclure à une amélioration du rendement de ponte par les "Precocene", toutes les différences étant non-significatives selon le test de la médiane. 82 En résumé, dans les conditions de traitement appliquées ici, nous voyons que les "Precocene" n'ont aucune action antigonado- trope détectable à des concentrations inférieures à ICX) yUg/cm . A cette dose-ci, l'effet varie selon le moment du traitement (après, avant et après le repas) et selon le produit utilisé CPrecocene 1" ou "Precocene 2"). A dose égale, le "Precocene 1" est plus actif que le "Precocene 2". Ce dernier provoque une ponte retardée, mais seulement lorsqu'il est appliqué avant et après le repas. Le faible pourcentage de pontes enregistré chez les tiques traitées après le repas au moyen de "Precocene 1" (ICXD /ig/cm ) est probablement lié à l'oviposition fortement retardée de ce lot. Le Tableau 31 illustre ces dernières remarques. 3.7. VITELLOGENINES ET VITELLINES : PURIFICATIONS PARTIELLES ET COMPARAISONS Le dernier chapitre de notre travail a été consacré à l'étude des protéines synthétisées par la femelle lors de la vitello- génèse et incorporées dans les ovocytes. L'élaboration de ces substances dépend en effet des stimuli liés au repas sanguin et a la copulation. Notre étude s'inscrit donc dans une suite logique de processus métaboliques dépendant les uns des autres. 3-7.1. Disc-électrophorèse sur Polyacrylamide Des extraits bruts d'hémolymphe et d'oeufs, passés sur disc- electrophorèse de Polyacrylamide, nous ont donné une série d'informations, par une coloration totale (fig. 15 A) et par trois colorations spécifiques permettant d'identifier les glycoprotéines (GP), les lipoprotéines (LP) et les hémoprotéines (HP) (fig. 15 B1C1D). Nous avons volontairement laissé de côté les plus fines bandes apparaissant sur le gel, car nous dési- rions avant tout étudier les protéines jouant un rôle quantita- tif important lors de la vitellogénèse. Nous n'avons donc pas décrit dans le détail l'électrophorégramme de l'hémolymphe et des oeufs. 83 O)(N Cm E U O) IU 1-1 •O CIt a U 3 y (O •H 3 z T! (N O H 4-> a ü) 0) rH •a dl 00 C 0) i, U C) O O U H S CI) O, •a m X CD 3 O (0 ¦o CO 11) 3 C 0) T T) a O tl) O 3 CT 4J *-l C iJ m •Cl) >, tì CTl W C »j >, 0) CO O) 3 (i) CC! •rJ Cl) tj 1-1 1-1 Xi (!) g H C 3 ai r-l .O CU H 3 .. Il i II ¦ m ¦ CO ¦ lit il i II d IO "'! Il I Il I I n m • I CO Il I I il i .5. . . ! « Il I U h 11 m ' -J II I I IO i ai n il Il II I '] I Il II I ")>H(P II 1J I CO Mil! if I IUI Uli I II I I I ITI I H I I 1 I i I Il i I II i Il II I I I AUUA < •0 . CU 3^x) r-lS^ ' P. C 0 i O r-l U /3 (0 (0 £ r-l O (0 O <,0 I« 1-1 -ri 3 O P BE -ri ¦0 -O - £ Xl X) - (0 Xl (0 PHN (0 3, • >, (X. O k OX 0P- X! -ri r-l OO C* X ir .—s O (0 C 0 0 •0 P 0 £»£ © .H £ 0 k ap H e e >>» C r-l U-. O a 0 e 3 (0 O-P (0 xij: o 0 (0 - Ü8 o Ç>C"t 0 XJ 0 P P C C 0 0 I (0 0 > 3 -ri CT3 (0 O" £"0 & 0 « O £ •c S n (0 (0 P 14-1 (0 3 P O > 8 o e O 0>0 k <->-x. CQ X) O 0 C -H 3 k 0 k •o 3 O .(0 C P P 0 0 (D (0 0 0 ûC OC k k 0 0 •w •r* > > 0) m 0 0 %% Q) QJ U •OTJg 0 0 -O ££ a ace Ë Ë >,:>-> » r-l r-l «H O O 3 ë e a >0>0 0 XXX) k 300 O ) (0 ce ¦ri 3 a. (0 0 •ri X) 3 a m 0 0 X) -ri (0 k O k C 3 o m C 0 r-l (0 r-l 3 XJ C O a £ Ü «r( (0 k «tfl aj . E U-, >0 co rH U-. 0 0 3 3 x) xi a 0 o o 0 0 (J - £ £ X) aap E e c p >-, >> (0 -ri r-l rJ ^ (0 O O (0 k e e p •0 -0 P X IIDu 85 Dans l'hémolymphe tout d'abord (flg. 15 A), 11 apparaît trois bandes (HL,, HL^ et HL-,) susceptibles d'être des vltellogénines. Elles sont absentes chez les mâles et les femelles vierges à jeun. Toutes trois sont des hémoglycolipoprotéines (HGLP). Il existe également une glycolipoprotéine (GLP) non spécifique du sexe (HL,), dont la concentration augmente dans l'hémolymphe des tiques nourries, quels que soient leur sexe et état (vierge ou copule). Les protéines correspondant aux bandes HLr et HLg ne font partie d'aucune des trois catégories GP, LP ou HP, alors que HL-, et HLg sont des hémolipoprotéines (HLP) . Ces deux dernières bandes sont plus concentrées chez les mâles et les femelles vierges à jeun que chez les femelles nourries. Dans l'oeuf, il apparaît trois fines bandes près de la zone de dépôt , puis une autre bande plus concentrée (0,). Ensuite, on observe deux raies minuscules et une bande (OO qui est aussi marquée que 0,. La bande Oo se présente sous forme d'une énorme tache et montre nettement les quatre réactions positives (protéines totales, GP, LP et HP). Oo est donc une HGLP. En observant attentivement le gel par transparence, on peut aper- cevoir des traînées verticales entre trois zones plus sombres à l'intérieur de la tache. Cette observation suggère l'hypothèse d'une fragmentation de molécules durant l'électrophorèse. Les bandes suivantes Oa1 Ofi et O7 ne se colorent pas spécifiquement; par contre, Or montre les réactions d'une GLP. Par la suite, nous avons voulu purifier les protéines constitu- ant les trois bandes les plus marquées, à savoir 0-, en ce qui concerne les oeufs, ainsi que HL-. et HL, pour l'hémolymphe. Etant donné la quantité relativement limitée de matériel à disposition, il n'a malheureusement pas été possible de purifier les autres bandes. Pour les raisons évoquées au début du paragraphe, nous n'avons pas numéroté ces trois bandes. 86 3.7.2. Purification des protéines majeures de l'oeuf Cinq cents oeufs fraîchement pondus ont été homogénéisés dans 5 ml de tampon Tris-HCl pH 8,2. L'électrophorèse sur Polyacry- lamide d'une partie du surnageant après centrifugation, corres- pondant à l'équivalent de 1,25 ou 2,5 oeufs, a montré la pré- sence de plusieurs bandes (0, à Oy) (fig. 18: 2 et 5), confor- mément à la figure 15 A. Le reste du surnageant a subi une précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium. Le précipité a été redissout dans 0,5 ml de tampon Tris-HCl pH 8,2. Après cette étape, l'électrophorèse sur Polyacrylamide d'un échan- tillon représentant l'équivalent de 2,5 oeufs a montré que la précipitation fractionnée n'apporte presque rien à la purifica- tion du broyât (fig. 18: 1), si ce n'est une certaine diminu- tion de l'intensité des bandes Oa, O1-, 0-, et de la bande frontale. Le reste du précipité en solution a été appliqué sur une colonne de Bio-Gel A-5M (0: 15 mm, Ii 600 mm), avec pour éluant le même tampon Tris-HCl. La figure 16 illustre le profil d'élution obtenu. Un très gros pic est apparu entre les volumes d'élution 600 et 1100 gouttes environ. Celui-ci a été suivi par deux petits pics dont les sommets étaient respectivement situés aux volumes d'élution 1200 et 1400 gouttes. Ces trois pics ont été appelés respectivement OP, ("oeuf purifié - 1ère étape"), °1200 et °1400- Un échantillon de la fraction OP,, équivalant à 2,5 oeufs, a été à nouveau soumis à une électrophorèse sur Polyacrylamide (fig. 18:3). Seule la bande 0, a subsisté, attestant une bonne purification après la colonne Bio-Gel. Une purification plus poussée a été tentée par la technique de la Chromatographie échangeuse d'ions. La fraction principale OP. a été récoltée, concentrée jusqu'à 1 ml (Minicon B-15) et passée sur colonne DEAE-Sephadex A-25 dans le tampon Tris-HCl pH 8,2, avec un gradient linéaire de NaCl (0-200 mM). Deux pics sont apparus (fig. 17); l'un nettement majoritaire a été élue entre 150 et 300 gouttes environ, suivi par un petit pic élue par le NaCl 15 mM entre 320 et 400 gouttes. Ces deux pics ont 87 1500 Volume d'élution en gouttes FIGURE 16 Profil d'élution après filtration sur gel d'un broyât d'oeufs --------- fraîchement pondus. 5O0 oeufs fraîchement pondus sont homogénéisés dans 5 ml de tampon Tris HCL pH 8,2. Après centrifugation, le surnageant subit une précipitation fractionnée au sulfate d'ammonium. Le précipité est redissout dans 0,5 ml de tampon et appliqué sur une colonne de Bio-Gel A5M (i> i 15 mm, 1. t 600 mm), avec le même tampon pour êluant. La fraction principale (730 à l'030 gouttes) est récoltée en vue de purifications supplémentaires; les fractions correspondant au sommet des pics (l'2O0 et 1*400 gouttes) sont également récoltées, lyophilisées après dialyse et conservées en ampoules scellées. été appelés respectivement OP2 ("oeuf purifié - 2èrae étape") et O15. Des échantillons du pic OP2 équivalant à 0,5, 1,25 et 2,5 oeufs ont été déposés sur un gel pour effectuer 1'électropho- rèse sur Polyacrylamide (fig. 18: 4, 6, 7). Seule la bande O^ a subsisté avec une légère séparation en plusieurs bandes réunies par des traînées protéiques (fig. 18: 6,7). Les fractions correspondant au grand pic ont été récoltées et mises à dialyser pendant 24 heures. La fraction éluée avec environ 15 mM NaCl (0,c) a également été dialysée. Finalement, les deux échantillons ont été lyophilisés et conservés en am- poules scellées. 88 % transmission (280 nm) J*£_ conc. NaCI ¦100 1500 Volume delution en gouttes Profil d'êlution de la fraction protéique majoritaire d'un broyât d'oeufs après passade sur colonne échanfieuse d'ions. La fraction majoritaire d'un broyât d'oeufs (FiR. 16) est récoltée, concentrée jusqu'à 1 ml (Mintcon B-15) et passée sur colonne échangeuse d'ions (DEAE Sephadex A-25) dans un tampon Tris-HCl pH 8,2 avec un gradient linéaire de NaCl (0-200 mM) (traitillés sur le graphe). La partie correspondant au grand pic est récoltée, mise à dialyser durant 24 heures, lyophilisée et conservée sous le nom de OP7 ("oeuf purifié-2e étape"). La fraction sortant avec environ 13 mM NaCl (0,*-) subit le même traitement. Les pics 0-|2oo et °14oo obtenus après colonne Bio-Gel ont aussi été analysés par électrophorèse sur Polyacrylamide. L'électro- phorégramme obtenu est donné dans la figure 19. Contrairement à ce qui pouvait être attendu, les bandes observées après électro- phorèse de nos échantillons n'ont pas migré dans la zone des faibles poids moléculaires, mais sont apparues de façon très marquées au même niveau que les bandes 0,, O, et O^ des broyats bruts, notamment. Le passage de l'échantillon lyophilisé O^qq sur une colonne Bio-Gel A-5M en vue de la détermination de son poids moléculaire a montré le même résultat surprenant. D'après son volume d'êlution sur la colonne lors de la première purification, le Poids moléculaire de 0, ?m devait se situer entre 20'00O et ^O'OOO. Or, cette substance a présenté un volume d'êlution 89 FIGURE 18 Disc-électrophorèse sur Polyacry- lamide des divers Stades de purifi- cation de Oj. 1) Apres précipitation au (NH^)2 SO4 (équiv. 2,5 oeufs) 2) Broyât brut d'oeufs (équiv. 1,25 oeuf) 3) Immédiatement après passage sur colonne de Bio-Gel (équiv. 2,5 OeUfSXOP1) 4) Immédiatement après passage sur colonne de DEAE-Sephadex (OP2) (équiv. 2,5 oeufs) 5) Broyât brut d'oeufs (équiv. 2,5 oeufs) 6) Idem 4) (OP2) (équiv. 0,5 oeuf) 7) Idem 4) (OP2) (équiv. 1,25 oeuf) 1 2 3 6 FIGURE 19 Disc-électrophorese sur polyacry- lamide de O1200 et O1400 1) °i2oo ^50 y1 ' éctuiv- 50O oeufs) 2) Broyât brut d'oeufs (équiv. 1,3 oeuf) 3) Broyât brut d'oeufs (équiv. 3,3 oeufs) 4) O1400 (50 y\ : équiv. 500 oeufs) 90 correspondant à un poids moléculaire de 2'000'000 lors du second passage sur la colonne. Ces deux expériences tendraient à montrer que les fractions pro- téiques O^nn et ^1400 corresPondraient en fait à une ou plu- sieurs grande(s) protéine(s) fragmentée(s). Ces fragments pour- raient être des sous-unités capables de réarrangements pour for- mer à nouveau des protéines de fort poids moléculaire. La présence d'un artefact ne peut également être exclue. O1200 et 01400 seraient alors le résultat d'une adsorption partielle et momentanée de OPt sur le gel, due à une surcharge de l'échantillon. Il apparaît donc que quatre fractions protéiques principales sont présentes dans les oeufs. La plus importante, OPo, correspond vraisemblablement à la bande Oo obtenue par électrophorèse sur Polyacrylamide du broyât brut. Trois fractions protéiques de moin- dre importance ont pu être isolées: O-j^oo* ^14no eC ^15- 1^8 Cr°i-S substances ont été récoltées en faibles quantités (quelques centai- nes de /^g). Par contre, OP-, a représenté 35 à 40 mg de produit sec pour 500 oeufs. 3.7.3. Etude de quelques caractères physico-chimiques de la fraction protéique QP-, 3.7.3.1. Détermination du poids moléculaire Le passage de la fraction OP2 non lyophilisée sur colonne Bio-Gel A-5M nous a indiqué que cette protéine possède un poids moléculaire apparent très élevé, voisin de 2,0 • 10 (fig. 20). En répétant l'opération avec un échantillon préalablement lyophilisé puis rc- dissout dans le tampon, nous n'avons perçu aucune différence no- table au niveau du volume d'élution et de la forme du pic. 3.7.3.2. Electrophorèse de OP, lyophilisé L'électrophorèse de OP-, lyophilisé a conduit à une résolution en deux bandes principales et plusieurs plus petites (figure 21). Deux fines bandes ont présenté des Rf identiques à ceux de 0-, et O2, trouvés lors de 1'électrophorèse des broyats bruts. Les deux zones fortement marquées correspondent à la plage couverte Par Oo. Cela confirme les soupçons relatifs à une fragmentation 91 fCHVMOTRVPSMOOCM * XYTOCHItOMK C % TIMNMUMWN •LUC-DEXTRAN A. FIGURE 20 Détermination du poids moléculaire de OPt par filtration sur gel. Un échantillon de 150 ^ est appliqué sur une colonne de Bio-Gel A-5M de 600 mm de long et de 15 mm de diamètre. L'élution est réalisée par du tampon phosphate pH 7,0 + 0,5 M NaCl. La calibration est effectuée grâce à des protéines de poids moléculaire connu. Lquation de la droite de régression ! y = -0,01318 x + 17,12. Chaque groupe de protéines standards est testé plusieurs fois, ainsi que la protéine native (OP^) . Les volumes d'élutton des différentes substances sont assez repro- ductibles, les petites variations d'un test à l'autre étant de l'ordre de quelques gouttes. 1) OPt est appliqué sur la colonne immédiatement après la purification sur échangeur d'ions, sans lyophilisation préalable. partielle de O^ au cours des manipulations. Peut-être O^ et O7 représentent-elles respectivement un tetramere et un dimère de notre substance. Leur position sur le gel n'exclut en tout cas pas cette possibilité. 3.7.3.3. Comparaison des _électronhorégrammes _de OC2 lyophilisé, d'hémolymphe de femelles et de broyats d'oeufs Trente yUg de 0P?, l'équivalent de 12 Ml d'hémolymphe de femelles ayant copule et nourries depuis 8 jours ainsi que de deux oeufs 92 ont été simultanément déposés sur un gel en vue d'une électro- phorèse sur Polyacrylamide (fig. 22). La bande la plus marquée de OP2 correspond très exactement à HL2 qui, rappelons-le, est une HGLP. La raie au-dessous migre à la même distance que HL,. Dans le broyât d'oeufs, O3 couvre la plage allant de HL, à HLo, bornes non comprises. 3.7.3.4. Détermination du gH isoélectrique de OP2 Le pH isoélectrique de OP2 a été déterminé par électrofocalisa- tion. Il se situe entre 6,7 et 7,2. Le manque de précision du résultat est lié à des difficultés techniques rencontrées au cours des expériences. En effet, les échantillons de OP2 utilisés , provenant d'un stock lyophilisé ou directement du dernier stade de la purification, ont migré sur le gel en laissant derrière eux des traînées de substance précipitée. A la fin de l'opération, nous avons obtenu une large tache compo- sée de 5 à 6 bandes mal résolues, ne permettant pas de donner une valeur précise au pH isoélectrique. 3.7.3.5. Spectre d'absorption de OP2 Ce spectre présente deux pics principaux, l'un à 278 nm et l'autre à 398 nm. Le rapport entre A™q et A2Tg s'élève jusqu'à 0,41 après purification. Plus loin, nous observons un plateau vers 500-510 nm, puis un autre aux alentours de 610 nm (fig. 23). 3.7.4. Etude des fractions protéiques de 1'hémolvmphe 3.7.4.1. Purification de HL3 et HL^ L'hémolymphe, récoltée à partir de femelles nourries et ayant copule depuis 10 jours, a donné un profil d'élution sur 93 paw» FIGURE 21 Disc-électrophorèse sur Polyacrylamide de OP2 après lyophilisation. 12 3 4 1) 20 yg 2) 50 y& 3) 20 j/g 4) 5 >/g FIGURE 22 Disc-électrophorèse sur Polyacrylamide des protéines de 1 *hémolymphe, de celles de broyats d'oeufs, ainsi que de OP2. 1) OP2OO Kg) 2) Hémolymphe de femelles nourries depuis 8 jours et ayant copule (12 y\) 3) Broyât d'oeufs (équiv. 2 oeufs) 1 2 3 94 I I I I I ¦ ï d'onda «in FIGURE 23 Spectre d'absorption de OP,. La mesure esc faite en solutLon aqueuse (tampon phosphate, pH 7,0). Il est à noter que HL-, présente un spectre identique. colonne Bio-Gel A-5M comportant deux pics principaux (fig. 24). Ces pics correspondent à HL, et HL,, puisque seules ces deux bandes sont très fortement concentrées dans 1'hémolymphe de femelles nourries depuis peu. Le premier pic (coloration brune) peut aisément être assimilé à HL, (HGLP), tandis que le second s'identifie à HL. (pas de coloration visible). A partir de l'étalonnage, on peut calculer les poids moléculaires des deux substances; celui de HL, vaut 2,7-10 et celui de HL, 0,7 - 106. Ayant répété l'expérience un certain nombre de fois, nous avons pu constater que la hauteur relative des deux pics n'est pas constante. Dans certains cas, HL, est plus concentrée et dans d'autre, HL, est présente en quantités plus grandes. Bien que prélevée toujours sur des femelles nourries depuis 10 jours, l'hémolymphe d'un échantillon ne montre pas, quantitativement, une composition reproductible de ses constituants protéiques. 95 • % TRANSMISSION (MO™) FIGURE 24 Purification et détermination du poids moléculaire des protéines de 1'hêmolymphe HL, et HL4 sur colonne Bio-Gel A-5 M (0 i 15 mm, longueur i 6OO mm). L'hémolymphe provient de femelles nourries depuis 10 jours et ayant copule. A. Etalonnage à l'aide de protéines standards. Equation de la droite de régression s y = - 0,004874 x + 10,42 B. Elution d'un mélange de 300 /A d'hêmolymphe centrifugée et de 100 /-1 d'un tampon phosphate pH 7,0. HL-> et HL4 sont alors collectées séparément et les protéines précipitées par addition de (NH4^SO4 solide (SO % sat.). Apres centrifugation, le culot est dissout dans 200 /J- de tampon phosphate pH 7,0 contenant du Blue-Dextran et de la DNP-Alanine. C. Elution de la fraction HL^ collectée précédemment (B). D. Elution de la fraction HL4 collectée précédemment (B). Après les étapes C et D, HL3 et HL4 sont dialysées et lyophilisées. Nous avons récolté 2,7 mg de HL-. et 2,5 mg de HL^. 96 Ce fait traduit les variations individuelles des 30 à 50 individus utilisés comme donneurs d'hémolymphe. En effet, la vitellogénèse est pratiquement terminée après 10 jours chez certaines femelles, alors qu'elle débute à peine chez d'autres. Nous n'avons pas analysé les variations relatives des concentrations de ces deux substances au cours du temps. 3.7.4.2. Sgectre d'absorption de HL, et HLa purifiées La fraction protéique HLa n'absorbe pas dans le visible; par contre, un pic d'absorption très net se situe à 278 nm. Nous n'avons pas représenté ce spectre ici. Le spectre de HL, est identique à celui de OP2 (cf. fig. 23). 3.7.5. Tests immunologiques Nous avons préparé du sérum contenant des anticorps anti-0P2 suivant la technique décrite sous 2.7.5.1. 3.7.5.1. îests_d^Ouchterlony Le sérum a été testé tout d'abord contre différentes quantités de OP2 (fig. 25). Une dose de 3 u% a encore été nettement détectée. Nous avons ensuite recherché les parentés immunologiques entre certaines substances, purifiées ou non (fig. 26). 0,2no' ^14OO et 0,,- présentent une parenté évidente avec OP2. puisqu'un arc de précipitation apparaît, ce qui renforce l'hypothèse d'une fragmentation de molécule. L'hémolymphe de femelles nourries et ayant copule est également antigénique, contrairement à celle des individus vierges et à jeun (fig. 26 A). L'arc correspondant a 0^200 est Plus éloigné du trou central que les autres. En admettant l'hypothèse d'une di- ou tetramerisation (voir 3.7.2.), nous pourrions expliquer le fait que la diffusion ait eu lieu a une vitesse plus faible. Cette supposition mérite d'être 97 FIGURE 25 Determination de la quantité minimale de proteine OP2 nécessaire à la réalisation d'un test d'Ouchte rlony. Un sérum anti-OP^, produit par sensibilisation d'un lapin, est utilisé à dilution l 1 I1 Diverses quantités de protéine 0P2 sont testées : 1) 15/.g 4) 1,5 /4g 2) 6 /.g 5) 0,3 /»g 3) 3 /g 6) 0,15 /g e 1 4 3 A B 98 FIGURE 26 Recherche des parentés immunologiques de la protéine 0P? avec différentes substances par le test d'Ouchterlony. Le sérum anti-OP, utilisé est à dilution 1:1. 1) OP2 15/48 2) Idem A 6) 3) Broyât d'oeufs (èquiv. I oeuf) 4) Hémolymphe de mâles nourris depuis 10 jours (2/-1) 5) Hémolymphe de mâles à jeun (2/a) 6) Id. A 4) 1) 0P? 15 //g 2) 0T 5 3 / O-iino1 O140n et O, [- se sont déplacés un peu plus loin. L'hémolymphe de femelles nourries et ayant copule ne présente qu'un seul arc, comme les autres échantillons testés. Toutefois, celui-ci est très allongé, et on peut supposer qu'il est probablement dû à plusieurs protéines différentes possédant un antigène commun. HL, et HL7, qui sont des HGLP, pourraient être ces protéines. Il est néanmoins très difficile, sur de telles plaques, de tirer des conclusions concernant de faibles différences de migration. En effet, dans les mêmes conditions d'expérience, le 99 FIGURE 27 Recherche des parentés immunologi- ques de la protéine OP, avec diffé- rentes substances par aranunoélec- trophorèse. Le sérum anti-OB, utilisé est à dilution 1 i 1 A. 1) OF235 j/g 2) Broyât d'oeufs (équiv. 1 oeuf) 3) Hémolymphe de femelles nourries depuis 10 jours et ayant copule (2 i/l) A) OP2JSyS, 5> °1200 10 >"* B C. 1) OP220 yg. 2) Id. A 2) 3) HL 3 purifiée 10 y g 4) HL 4 purifiée 10 yg 5) Id. A 3) broyât d'oeufs s'est moins déplacé sur la première plaque (fig. 27 A) que sur la seconde (fig. 27 B). Par contre, le phénomène inverse s'est produit pour 0,2nf). Malgré une coloration générale de faible intensité, l'immuno- électrophorégramme de OP2I HL, et HL, purifiés a permis d'obser- ver un arc de précipitation pour OP2 ainsi que pour HL^ (fig. 27 C). Cette dernière substance a migré relativement loin de la zone de dépôt et l'extrémité distale de son arc de précipitation correspond approximativement à celle de l'arc obtenu avec l'hémolymphe brute de femelles nourries depuis 10 jours et ayant copule. HL4 n'a montré aucun arc de précipita- tion, confirmant en cela les résultats des tests d'Ouchterlony. 3.7.6. Disc-électrophorèse en SDS de différentes protéines purifiées Pour compléter nos résultats, nous avons procédé à des éleccro- phorèses en SDS des trois protéines purifiées, HL^, HL^ et OP2. Un premier essai nous a permis de répertorier les sous-unités composant ces protéines (fig. 28A). On peut observer des bandes bien marquées à 7 niveaux différents (a, b, c, d, e, f, 8). HLo présente 4 sous-unités (niveau a, b, c, d) que nous avons appelées HL^a, HLob, HL^c et HL,d. HLob semble en fait être composée de 2 bandes distinctes, alors que HL* ne montre que 2 sous-unités (HL^d et HL^e). La bande apparaissant au niveau a résulte probablement d'une contamination avec HLg, découlant d'une purification incomplète. OP2 est composé de 6 sous- unités (0P2b, OP2C, OP2d, OP2e, OP2ff C^g) . Les deux der- nières sont plus faiblement marquées et pourraient éventuel- lement provenir d'une contamination avec d'autres protéines de l'oeuf. OP2b se présente comme une seule tache, contraire- ment à HLjb. Un deuxième test a confirmé les observations du premier (fig. 28 B). Ici néanmoins, HL^b n'apparaît pas scindé en deux 101 f 9 *:** # FIGURE 28 Electrophorèse en SDS des protéines HL3 , OP2 et HL/,. A. 1) HL3 2) OP2 3) HL4 4) OP2 5) HL3 6) HL4 7) OP2 102 ^~ . 1) HL3 2) HL4 3) OP2 4) Protéines standards 5) HL3 6) HL4 parties et C^d migre plus loin que HLod et HL, d. Cela provient vraisemblablement de la trop grande quantité de substance placée dans la fente no 3. Grâce à des protéines standards, nous avons pu estimer le poids moléculaire des différentes sous-unités (fig. 29). Nous ne savons évidemment pas si les bandes enregistrées à des niveaux semblables correspondent aux mêmes molécules. Néanmoins, nous voyons sur le tableau de la figure 29 que les poids moléculaires s'échelonnent entre 190.000 et 49.000, du niveau a au niveau g. Dans cette analyse, nous n'avons tenu compte que des bandes majeures constituant les protéines étudiées. Nous avons par exemple négligé, chez HL-, une zone faiblement colorée, située 1) entre HL,d et HL,e '. Pour résumer nos observations, relevons que OPt est constitué principalement de six sous-unités, HLo de quatre et HL, de deux (Tableau 32). Il semble en outre que des correspondances puissent exister entre certaines d'entre elles, appartenant à des protéines différentes. Cette position correspond à un poids moléculaire de 110.000 environ. 103 L__4-----J 5,0- 4,5- 4,0 Log PM \« myosine -galactosidase Phosphorylase B it nrn n 0,1 0.2 0,3 ^BSA 0,4 ovalbumine niveau PM a 190000 b 150 000 C 135 000 d 120 000 e 98000 f 69 000 g 49000 ~i—3~r- 0,5 0.6 0.9 1,0 0,7 0,8 Rf FIGURE 29 Determinati on du poids moléculaire des sous-unités composant OP^, HLt et HL, sur un gel SDS de Polyacrylamide à 10 %. Le gel est étalonné grâce à des protéines standards de poids moléculaire connu (voir fig, 28 B). Les Rf obtenus pour a, b, c, d, e, f et g sont reportés sur la droite d'étalonnage afin d'estimer les poids moléculaires correspondants. Equation de la droite de régression : y = - 1,206 x + 5,38 Le tableau figuré consigne les résultats obtenus. 104 ^^^^ Protéine Niveau ^^^^ HL3 HL4 OP2 a ¦¦¦ b ¦!¦ ¦¦¦ C ¦¦¦ ¦¦i d ¦¦¦ ¦¦¦ ¦¦¦ e ¦¦¦ ¦¦¦ f ¦¦¦ 6 ¦¦¦ Tableau 32 : Protéines purifiées à partir de 1'hémolymphe et des oeufs : synthèse des résultats obtenus en électrophorèse SDS. Présence ou absence d'une sous-unité au niveau correspondant. 105 4. DISCUSSION 4.1. PARAMETRES DE L'ELEVAGE Nos résultats concernant la mesure de différents paramètres de l'élevage démontrent tout d'abord la difficulté de travailler avec 0. moubata. la souche utilisée se comportant de manière hétérogène. Ainsi, les poids moyens des tiques ne sont pas comparables entre eux au cours du temps, ceux-ci ayant eu tendance à augmenter entre 1975 et 1979. Les causes de ces variations nous sont partiellement inconnues. La souche, con- servée depuis une vingtaine d'années dans notre laboratoire, a été périodiquement "rafraîchie" par l'apport de nouveau maté- riel. Cet apport pourrait expliquer en partie les variations enregistrées. Quoi qu'il en soit, nous avons pris un maximum de précautions lors des expériences, notamment en répartissant les femelles de façon purement aléatoire à l'intérieur des lots et en prenant bien soin d'avoir des lots témoins en suffisance pour chaque essai. Certains paramètres sont plus stables que le poids. Il s'agit en particulier du "rendement" de la ponte exprimé par le rapport Rt .En moyenne, une femelle pond 0,72 oeufs par milligramme de sang ingéré, ou encore 0,39 mg de "matière" pour 1 mg de sang ingéré. Soulignons que ce rapport est relatif puisque nous mesurons le poids frais des oeufs et le poids de sang concentré après élimination du liquide coxal. Le rapport entre poids gorgé et poids à jeun (R-,) est également un critère stable. Une femelle de 0.moubata quintuple approximativement son poids après un repas sanguin, sans compter le liquide coxal éliminé pendant et sitôt après la nutrition. En corrigeant ce facteur par les données de BALASHOV (1972) concernant 0. tholozani. nous obtenons chez 0. moubata un poids de tique gorgée environ l) défini sous 3.1.3. tel que : R9 = nombre d'oeufs pondus M l poids de sang ingère 106 huit fois supérieur au poids à jeun . Ce résultat est en accord avec les chiffres cités par BALASHOV; cet auteur indique un accroissement de 5 à 12 fois pour les Argasides. Le poids des ovaires secs est un critère intéressant, bien qu'il soit difficile d'obtenir des mesures homogènes chez les femelles accomplissant leur vitellogénèse. Le poids des oeufs varie peu d'un échantillon à l'autre ; sur quatre lots pesés, les différences enregistrées n'excèdent pas 3,2 %. Le poids moyen d'un oeuf se situe au voisinage de 0,54 mg. Cette étude préalable nous a permis de constater que, malgré certains paramètres fluctuants (poids moyen des femelles et durée de préoviposition notamment), il est possible de travail- ler avec 0. moubata moyennant de sérieuses précautions quant à la conception des expériences et à leur interprétation. 4,2. STIMULATION DE LA VITELLOGENESE AU MOYEN D'UN FACTEUR CHIMIQUE PRODUIT PAR LE MALE Nos résultats fixent la valeur du poids moléculaire de ce facteur entre 1'600'000 et 1'9OO'000. Il faut cependant relever que ces données ne sont pas absolues. En effet, la substance active est éluée sur la colonne en un temps plus court que la ferritine, qui constitue la protéine standard la moins retenue de notre droite étalon. Cela nous oblige à extrapoler a partir de cette droite et la moindre imprécision dans l'étalonnage peut alors modifier la valeur cherchée. D'autre part, le poids moléculaire estimé dans ce travail constitue un poids apparent. valable seulement pour les protéines "sphériques". Or, il est connu que certaines glycoprotéines en particulier ont un poids moléculaire réel bien inférieur à celui que l'on peut mesurer par filtration sur gel (ANDREWS, 1964, 1965). Nous ne pouvons BALASHOV signale une perte de liquide coxal représentant le 39 % du poids de sang ingéré chez la femelle de 0. tholozani. En supposant qu'il en est de même chez 0. moubata. nous pouvons calculer l'augmentation de poids reelle. 107 également exclure la formation d'agrégats entraînant une surestimation de la taille des molécules. Néanmoins, il est très probable que la substance active se présente sous la forme d'une grosse molécule. Nous confirmons donc ici les résultats de GERMOND & AESCHLIMANN (1977) qui indiquent un poids moléculaire d'au moins 150'00O, pour cette substance. Ces auteurs soulignent d'autre part la grande thermolabilité du produit et formulent l'hypothèse qu'il s'agit d'une protéine ou d'un complexe protéique. Chez les insectes, plusieurs auteurs ont isolé des substances analogues produites par le mâle et stimulant la vitellogénèse et la ponte chez la femelle. Ces composés sont des peptides chez Drosophila melanogaster (BURCKHARDT, 1975), des dérivés d'acides aminés chez D. funebris (BAUMANN, 1974) ou encore des protéines chez Aedes aegypti (FUCHS & HISS, 1970). La taille de ces molécules actives est relativement modeste comparée à nos résultats. Le poids moléculaire est inférieur a 3000, sauf pour la matrone ex. , présente dans les glandes annexes du mâle d'A. aegypti (P.M. = 60*000). Chez 0. moubata. nos résultats montrent que l'activité de la substance persiste après digestion par la trypsine, bien que les conditions d'incubation soient proches de l'optimum pour l'enzyme (pH 8,0; température : 30° C). D'autre part, l'activité de cette substance se perd au cours d'une ultrafiltration (Sephadex, ou Minlcon B-15), empêchant ainsi de concentrer le produit à des fins d'analyse. A l'aide des tests biochimiques de LOWRY & al (1951)1^ et de SEDMAK & GROSSBERG (1977)2\ nous n'avons jamais pu mettre des protéines en évidence dans les fractions actives, au sortir d'une colonne de Bio-Gel. Ces observations peuvent nous amener à douter de la nature protéique de la substance. On peut toutefois supposer qu'un des seuil de sensibilité : 5 à 10 /¾ d'albumine par ml. 2) ' seuil de sensibilité : 0,5 /Ug d'albumine par ml. 106 polypeptides qui serait libéré par l'action de la trypsine reste actif. Il est également possible que les conditions d'hydrolyse, choisies pour être optimales, ne permettent pas une digestion complète de la substance. En effet, la durée d'incubation, fixée à 30 minutes, est peut-être trop courte et une faible activité résiduelle suffirait à laisser croire que la protéine est encore intacte, bien que la caséine soit digérée à plus de 95 % dans les mêmes conditions expérimentales. Il est par conséquent établi que si la.substance active est une protéine, elle agit à très faible concentration, comme le font les hormones. Ces observations nous amènent à formuler un certain nombre d'hy- pothèses quant à la nature de la substance active étudiée. Il s'agit peut-être d'une petite molécule, protéique ou non, incor- porée à un grand complexe. S'il en est ainsi, l'incorporation se fait vraisemblablement dans le spermiophore. Rappelons que les spermatides, chez les tiques, sont stockées au niveau des vési- cules séminales du mâle et n'accomplissent leur dernière phase de maturation que dans les voies génitales de la femelle (elon- gation et activation physiologique : revue par BALASHOV, 1972, & OLIVER, 1974). L'hypothèse qu'une petite molécule puisse être incorporée à un gros transporteur lors de la Spermiogenese a l'avantage d'expliquer pourquoi un broyât actif de vésicules séminales ne présente aucun effet dans les fractions à haut poids moléculaire, contrairement au surnageant de spermiophores prélevés chez la femelle ayant copule. Nos recherches ont confirmé que les homogénats de testicules, ou de glandes annexes, n'ont aucun effet gonadotrope chez la femelle, contrairement aux broyats de vésicules séminales. Ceci appuie les résultats d'AESCHLIMANN (1968) et GERMOND & AESCHLIMANN (1977). Il semble bien établi que ce sont les spermiophores eux-mêmes qui synthétisent, ou du moins qui activent et transportent la subs- tance concernée. Celle-ci serait libérée dans la femelle après la copulation. Il nous semble donc judicieux d'assimiler ce produit 109 ! à une phéromone , bien qu'il n'ait un contact avec le milieu extérieur que dans l'utérus de la femelle. Chez les insectes, les travaux publiés montrent que de telles substances sont synthéti- sées au niveau des paragonies, ou glandes annexes du mâle et trans- portées vers la femelle par le fluide séminal (FUCHS & HISS, 1970; BAUMANN, 1974j revue par HINTON, 1974, HUIGNARD & al, 1977). Ces produits sont de même susceptibles d'être définis comme des phéro- mone s. Chez certaines tiques, le fluide séminal véhicule également la ou les substances actives (Dermacentor variabilis î PAPPAS & OLIVER, 1972j Amblyomma hebraeum s SPICKETT, 1978; 0. tholozani; GALUN & WARBURG, 1967). Cependant, ces auteurs ne prouvent pas que la synthèse ait lieu dans les glandes accessoires. Aucun de ces travaux ne met en évidence la nature chimique du produit actif, ni son poids moléculaire. GALUN & WARBURG suggèrent qu'il pourrait éventuellement s'agir de catecholamines chez 0. tholozani. ce qui n'a toutefois pas été prouvé. 0. moubata représente donc le seul exemple connu d'Arthropode où les spermiophores véhiculent eux-mêmes le messager chimique per- mettant le déroulement complet du processus vitellogénèse-ponte, chez la femelle. En plus du transport, il se pourrait même que le spermiophore soit responsable de la synthèse du produit; ceci reste cependant à démontrer. Nous avons établi également que le stimulus persiste sur une assez longue durée chez la femelle (deux mois et demi au minimum), comme si un "commutateur" était enclenché une fois pour toutes. Ces ob- servations mériteraient d'être complétées en suivant le phénomène sur une plus longue période. AESCHLIMANN & GRANDJEAN (1973 b) ont d'ailleurs montré que des femelles de 0. moubata ayant copule une seule fois peuvent pondre tous les 3 mois durant 2 ans, moyennant un repas de sang chaque trimestre. Mais la présence de spermiopho- res vivants dans l'utérus, suite à la copulation, interdit une comparaison directe avec nos résultats. Selon KARLSON & LUSCHER (1959), une phéromone est une substance sécrétée par un individu dans le milieu extérieur et agissant sur un autre individu de la même espèce, chez lequel elle pro- voque une réaction comportementale ou un processus de développe- ment. 110 4.3. STIMULATION DE LA VITELLOGENESE PAR L'ACTION MECANIQUE DE LA COPULATION Chez les femelles vierges d'O. moubata. la stimulation mécanique par des billes d'acier placées dans l'utérus permet le déroulement complet de la vitellogénèse et de la ponte. Le nombre d'oeufs récoltés, bien que variant d'un lot à l'autre, est en général un peu plus faible que chez les témoins ayant copule. Le rôle de l'utérus dans la transmission du stimulus n'est pas clairement établi. Le vagin, par exemple, pourrait aussi être impliqué dans ce processus, puisqu'il est également distendu par le passage des billes. Soulignons que nous ne savons pas si la distension est vraiment nécessaire au déclen- chement du stimulus. Il est possible que le simple frottement des billes dans le système génital suffise à induire le signal. Nous ignorons également si ce signal est transmis par voie nerveuse ou humorale. Nos travaux sont à rapprocher de ceux d'OLIVER (1975) sur Amblvomma americanum et de LEAHY & GALUN (1972) sur Argas persicus. Ces auteurs montrent en effet qu'une action mécanique stimule la vitellogénèse chez A. americanum et A. persicus. Mais ce stimulus est incomplet puisqu'il n'induit pas la ponte, ni même l'ovulation. Chez 0. moubata. au contraire, nos résul- tats démontrent que la stimulation fait pondre une femelle vierge. Chez plusieurs espèces d'insectes, la copulation influence positivement la vitellogénèse et la ponte par un moyen purement mécanique. L'implantation d'un spermatophore artificiel dans la bursa copulatrix d'une femelle de Diploptera provoque le même effet sur la maturation des oeufs qu'une copulation normale (ENGELMANN, 1959; ROTH & STAY, 1961); une telle implantation, ainsi que l'accouplement avec un mâle castré, active la vitello- génèse chez la femelle de Leucophaea (ENGELMANN, I960). Ill Aucun phénomène de synergie entre stimulation mécanique et chimique n'a clairement été mis en évidence lors de nos expériences, en raison du faible nombre d'individus utilisés. Toutefois, l'action chimique à elle seule paraît plus effi- cace que l'action mécanique. Chez 0. moubata. la copulation provoque donc la vitellogénèse et la ponte par deux stimuli, l'un chimique et l'autre mécani- que. 4.4. STIMULATION DE LA VITELLOGENESE PAR L'IMPLANTATION DE "CERVEAUX" Nos résultats indiquent de façon claire que l'implantation de "cerveaux" stimule la vitellogénèse de femelles vierges et nourries depuis 100 jours. Mais cette stimulation ne supplée pas la copulation normale puisqu'elle ne provoque pas la ponte. Les ovocytes accomplissent une vitellogénèse abortive, compa- rable à celle décrite par AESCHLIMANN (1968) et GERMOND Se AESCHLIMANN (1977) chez les femelles vierges et nourries. Mais il est difficile d'observer des différences dans la réponse au stimulus, selon l'état du "cerveau" transplanté. En effet, ni le sexe, ni l'état physiologique du donneur ne semblent avoir une grande influence sur la réponse enregistrée. La présence ou l'absence du complexe rétrocérébral n'apporte pas non plus de modification notable dans les réponses observées. AESCHLIMANN (1968) a montré, chez 0. moubata. que des broyats de "cerveaux" provenant de femelles nourries et ayant copule, in- jectés dans l'hémocoele de femelles vierges juste avant le repas sanguin, provoquent la ponte après une période normale de pré- oviposition. Par contre, si les "cerveaux" broyés proviennent de femelles vierges (à jeun ou non), l'injection n'a pratiquement pas d'effets. Nous avons répété ces expériences, mais en injectant 112 les homogénats à des femelles vierges et nourries depuis 100 jours. Les résultats négatifs enregistrés (absence de vitellogénèse ou mort des individus, selon que le broyât avait subi ou non une centrifugation préalable) montrent bien qu'il est impossible de comparer directement les effets d'un traitement sur des tiques se trouvant dans des états physiologiques diffé- rents. Le repas sanguin, administré directement après l'injection, agit probablement comme un stimulus supplémentaire, puisqu'il permet l'ébauche de la vitellogénèse (AESCHLIMANN, 1968). Chez beaucoup d'espèces d'insectes, les stimuli liés à la copula- tion, la photopériode et la nourriture notamment, influencent l'organisme via les cellules neurosécrétrices (CNS) (voir revues par HIGHNAM, 1965; HIGHNAM & HILL, 1977). Chez Rhodnius prolixus. des neurosécrétions facilitent la ponte de la femelle (DAVEY, 1967, 1974). En ce qui concerne Locusta migratoria, le système neurosécréteur contrôle directement la biosynthèse des protéines au niveau des corps gras et également l'activité des corpora aliata (GIRARDIE, 1966). Chez les moustiques tels qu'Aedes aegypti, des neurosécrétions agissent directement sur l'ovaire de la femelle qui, lui, va contrôler la synthèse des vitellogénines au niveau des corps gras, par l'intermédiaire d'ecdysone (LEA, 1972; HAGE- DORN & FALLON, 1973; FALLON & al, 1974). Le cerveau joue donc souvent un rôle déterminant dans le cycle reproducteur de la femelle (revues de ENGELMANN, 1970; DOANE, 1973). Chez les tiques, plusieurs travaux montrent que l'activité neu- rosécrétrice du "cerveau" varie en fonction de la copulation et du repas sanguin chez la femelle (EICHENBERGER, 1970; EISEN & al, 1973; GABBAY & WARBURG, 1976). Nos résultats concernant les transplantations chez 0. moubata sont difficiles à interpréter et un certain nombre d'hypothèses peuvent être envisagées. Tout d'abord, il est possible que le stimulus appliqué soit de nature non-spécifique et que certaines Equivalent de un "cerveau" par femelle pour la dilution 1/1 113 substances, s'écoulant par des lésions de l'organe transplanté, agissent directement sur le processus de digestion en l'augmen- tant temporairement. A l'appui de cette hypothèse, rappelons que les "cerveaux" de tiques mâles se montrent également très actifs. La substance stimulante ne serait donc pas liée au sexe. Comme deuxième hypothèse, nous pouvons suggérer que des neurosécrétions spécifiques à 1'activation de la vitellogénèse jouent effective- ment un rôle chez 0. moubata et que le petit nombre d'individus testé n'a pas suffi à mettre en évidence des variations quanti- tatives du taux de ces sécrétions. Les femelles d'0. moubata à jeun montrent d'ailleurs une légère activité neurosécrètrice, bien que celle-ci soit nettement plus faible qu'après le repas sanguin (EICHENBERGER, 1970). Il est probable également que l'activité neurosécrétrice du "cerveau" transplanté subisse l'effet d'un mécanisme de rétroaction de la part de l'hôte et modifie ainsi très rapidement son propre état physiologique après la trans- plantation. Une telle rétroaction est suggérée par GABBAY & WARBURG (1976) chez 0. tholozani. Ces auteurs observent que le nombre de cellules neurosécrétrices oscille faiblement entre le 2e et le 10e jour suivant le repas sanguin. Ils attribuent ces variations à un effet de rétroaction des différents stades de la digestion sur le "cerveau". 4.5. STIMULATION DE LA VITELLOGENESE PAR UN APPORT EXOGENE D'HORMONES JUVENILES. ETUDE DES EFFETS INHIBITEURS DES "PRECOCENE 1 et 2" Jusqu'à présent, l'endocrinologie des Arthropodes s'est princi- palement développée chez les insectes, où l'on a clairement mis en évidence le fait que les hormones juvéniles jouent un rôle important pour la vitellogénèse chez un grand nombre d'espèces. 114 Ces hormones agissent souvent comme dernier relais, en stimu- lant la biosynthèse des vitellogénines au niveau du corps gras et l'incorporation de celles-ci dans les ovocytes (voir revue par HIGHNAM & HILL, 1977). Les "Precocene" interfèrent sélecti- vement avec la biosynthèse d'hormones juvéniles dans les corpora aliata, chez certains insectes (BOWERS & al, 1976- PRATT & BOWERS, 1977; PENER & al, 1978; BROOKS & al, 1979; PRATT Se al, 1980). Un apport exogène d'hormone juvénile peut néanmoins rétablir une vitellogénèse normale chez Drosophila melanogaster par exemple (LANDERS & HAPP, 1980). Nos résultats montrent que l'injection d'un mélange de stereoi- somers des hormones juvéniles I et III provoque la vitellogénèse et la ponte chez des femelles d'O. moubata. vierges et nourries depuis 100 jours. La dose optimale est voisine de 50 microgrammes d'hormone par individu. Nous n'avons pu déterminer une différence spécifique d'activité entre JH-I et JH-III. D'autre part, les pontes enregistrées après injection d'hormones juvéniles sont plus tardives et moins abondantes qu'après une copulation normale. L'injection d'isomères naturels de JH-I et JH-III stimule la ponte dans moins de 15 % des cas. JH-II est par contre plus active (29 % de pontes pour une dose de 100 /*g par individu). Les iso- mères naturels des hormones juvéniles ont donc une action très faible, voire nulle, sur la vitellogénèse et la ponte d'O. moubata. Il est intéressant de noter que BASSAL & ROSHDY (1974) parviennent à stopper la diapause d'Argas arboreus et à provoquer la ponte chez des femelles nourries et ayant copule. Mais ces auteurs ne réussissent pas à induire la ponte chez des femelles vierges et nourries. Le produit utilisé est un analogue d'hormone juvénile et non l'hormone naturelle des insectes. Rappelons toutefois que 0¦ moubata ne subit pas de diapause, ce qui ne permet pas d'effec- tuer un rapprochement entre les deux espèces. Il s'agit de l'acétaldéhyde 2 - (2-ethoxyethoxy) éthyl-p- (méthylthio) phenyl acétal. 115 Nos observations contredisent celles de MANSINGH & RAWLINS (1977) qui constatent une nette inhibition de la ponte par différents analogues d'hormone juvénile chez Boophilus microplus. Précisons cependant que B. microplus est un Ixodide dont la biologie est très différente de celle des Argasides. Il est par conséquent difficile d'établir des comparaisons. Les traitements effectués sur 0. moubata à l'aide des "Precocene 1 et 2" ont des conséquences différentes suivant le produit utilisé, la dose administrée, ainsi que le moment où la tique est mise en contact avec la substance. Le "Precocene 1" (l00/ 0,. la bande a disparaît et les sous-unlté e, f g apparaissent. Si e de Oq provenait bien de e de HL-, on pourrait alors considérer cette dernière protéine comme une vitellogénine, mais avec les réserves énoncées plus haut. A première vue, il est difficile de trouver une explication à la provenance de f et g, ces sous- unités étant peut-être synthétisées par l'oeuf lui-même ou pouvant dériver de la fragmentation d'une autre bande (a, par exemple). On peut penser plus simplement qu'une autre vitello- génine les fournit, comme par exemple HL, et HL21 que nous n'avons pu obtenir purifiées du fait de leur relativement faible concentration dans 1'hémolymphe. La structure de HL3 se modifie donc notablement lors de son incorporation dans l'oeuf. Les modifications concernent l'assemblage des sous-unités et des pertes ou des scissions de fragments protéiques. Chez les insectes, par contre, les vitel- logénines subissent des changements relativement mineurs lors de leur incorporation dans le vitellus de l'œuf. La teneur en lipides peut varier (Philosamia cynthia : CHINO & al, 1976; Locusta migratoria : CHINZEI & al, 1981), ou les sous-unités se regrouper (trimérisation chez Leucophaea maderae : DEJMAL & BROOKES, 1972). Toutefois, aucune espèce d'insecte étudiée jusqu'à présent ne montre des modifications entre vitellogé- nines et vitellines aussi profondes que celles enregistrées chez 0. moubata. Pour les autres tiques, les auteurs n'ont pas analysé les transformations subies par les vitellogénines au cours de leur incorporation dans 1'ovocyte. Dans un travail ultérieur, il serait intéressant de purifier HL, et HL^. Ces deux HGLP semblent être des vitellogénines (elles ne sont présentes que chez des femelles nourries) et pourraient représenter des stades intermédiaires de la transformation supposée HL^--->0o. Leur électrophorèse en SDS nous fournirait probablement des données intéressantes. La situation de HLa est un peu particulière. Cette protéine est de petite taille, comparée à HL^ et O, (P.M.: 0,7 • 10 ). 120 Elle n'absorbe pas la lumière visible, donc ne porte pas de pigment du type "heme". Aucune parenté immunologique ne la lie à Oo . Par contre, ses deux sous-unités principales HL/, et HL, migrent respectivement à la même hauteur que Oo , et Oo . Nous ne pouvons évidemment pas conclure à une identité HL,. - Oo, et HLa^ - Oo , d'autant plus qu'il faudrait alors expliquer pourquoi le sérum anti-Oo reste inactif vis-à-vis de HL/. Des difficultés techniques liées à un manque de temps nous ont empêchés de colorer spécifiquement 1'électrophorégramme SDS des trois protéines purifiées. Il aurait été intéressant de savoir, par exemple, quelles sous-unités véhiculent le groupe- ment hème ou portent des sucres. De telles analyses pourraient se révéler utiles par la suite, afin de clarifier la situation. En reprenant les quatre critères de HAGEDORN & KUNKEL (1979)1^, nous pouvons admettre la dénomination de vitellogénine et vitelline, pour HLo et O3 respectivement, puisque toutes les conditions sont remplies. Signalons à propos du deuxième critère que l'origine extraovarienne du vitellus chez O. moubata a été montrée par la microscopie électronique (AESCHLIMANN & HECKER, 1967, 1969; JENNI, 1971). En ce qui concerne HL,, même s'il était prouvé que cette substance participe à l'élaboration du vitellus (ce qui est loin d'être le cas), on ne pourrait la nommer vitellogénine, car elle ne vérifie pas le troisième critère. En effet, sa présence en grande quantité dans 1*hémolymphe dépend de l'état "^D'après HAGEDORN & KUNKEL (1979), on peut admettre quatre critères qui permettent de définir les vitellogénines et les vitellines chez les insectes : 1°) Elles forment habituellement 60-90% des protéines solubles de l'oeuf. 2°) Elles ne sont pas synthétisées par l'ovocyte, mais par le corps gras. 3°) On ne les trouve en grandes quantités que chez les femelles et à certaines périodes seulement, d'où le terme couramment utilisé de "female specific proteins", ou encore plus simplement de "female proteins". 4°) Elles sont absorbées sélectivement par_1'ovocyte durant la vitellogénèse et concentrées Jusqu'à 100 fois à l'intérieur de celui-ci. 121 physiologique de l'animal (à jeun ou nourri), et non de son sexe (cf. fig. 15). Cela confirme l'hypothèse de DIEHL (1970) la classant comme "protéine alimentaire", avec la possibilité éventuelle de contribuer au stockage de vitellus. BOCTOR & KAMEL (1976) ont isolé deux lipovitellines antigé- niquement semblables, à partir des oeufs de D. andersoni. Ces protéines, possédant un poids moléculaire de 4,7 » 10 et 8,7 • 10 , ont tendance à se fragmenter lors du stockage ou de la lyophilisation des solutions. Des phénomènes identiques se sont produits avec O^ lors de notre travail. Ces auteurs décrivent des spectres d'absorption pratiquement semblables aux nôtres. Ce fait indique que les pigments inclus dans HL, et O^ pourraient être des protoporphyrines, ainsi que cela a été suggéré chez D. andersoni. WIGGLESWORTH (1943) montre d'ailleurs que les pigments découverts dans l'oeuf d'O. moubata se trouvent sous forme d'hématine alcaline. Malheureusement, la comparaison entre D. andersoni et O. moubata ne peut se faire au niveau des vitellogénines, BOCTOR & KAMEL n'en ayant pas isolé. Les vitellines de Dermacentor possèdent donc un certain nombre de points communs avec Oo, à savoir i un poids molécu- laire élevé (supérieur à 10 ), une nature similaire (HGLP) et un spectre d'absorption dénonçant la présence de groupes prosthétiques dérivant directement de l'hème prélevé dans le sang de l'hôte. Plusieurs travaux montrent par ailleurs que de tels groupes prosthétiques sont également liés à des vitellogénines et vitellines chez d'autres espèces de tiques (Ixodes ricinus : WIGGLESWORTH, 1943; Boophilus microplus : BREMNER, 1959; TATCHELL, 1971). 122 5. RESUME DES RESULTATS OBTENUS ET HYPOTHESES Au vu des différents résultats énoncés dans ce travail, nous pouvons tenter d'esquisser un schéma global, représenté dans la figure 30, et traduisant les conséquences du repas sanguin et de la copulation sur la femelle d'O. moubata. Les voies empruntées par les différents stimuli sont encore parfois hypothétiques et nécessiteront des travaux ultérieurs pour être clairement comprises. 1) Chez 0. moubata. la femelle peut se nourrir indépendamment de la copulation, mais elle en dépend cependant pour la ponte. La copulation permet non seulement la fécondation des ovocytes, mais aussi le déroulement complet de la vitellogé- nèse par deux voies distinctes, l'une mécanique et l'autre chimique. L'avantage d'un tel système se résume à une économie de matière nutritive. Seule la perspective d'une ponte viable permet le développement complet des ovocytes. Cette économie est d'autant plus intéressante pour l'espèce que la tique n'est jamais assurée de pouvoir se nourrir à intervalles réguliers. 2) Une stimulation chimique de la ponte n'est pas un phénomène rare chez les Arthropodes, nous l'avons souligné. Néanmoins, le système mis en évidence chez 0. moubata fait preuve d'originalité sur deux points, tout au moins. Il s'agit d'abord du lieu de synthèse de la substance active, situé vraisemblablement au niveau du spermiophore lui-même, et de la très grande taille apparente de la molécule. L'effet mécanique exercé sur le système génital par la présence de spermatophores accorde en somme une double assurance, permettant un bon déroulement de la vitellogénèse lorsque la femelle a copule. 123 C Ol n9 > C CTI CO in •H OT U cri U tx -J O 0 M C en ,fi) -1 CO C ¦a 'OJ ùi) W) U O H) QJ m •r4 f-l « > 0 U 4J O Of •r-l 4J Of ,> C/) w n .£> w T ci O >, R io m n IS 1O) N ti (I) C) fi fi U 124 3) Nous n'avons pu établir de façon claire le rôle du "cerveau" comme organe-relais. La vitellogénèse est faiblement stimu- lée par l'implantation de cet organe, mais cette stimulation pourrait être non-spécifique. 4) Les traitements effectués à l'aide d'hormones juvéniles proches de celles des insectes induisent la vitellogénèse et la ponte. Nous pouvons, de ce fait, supposer comme hypothèse de travail, qu'il existe un organe produisant des substances voisines des hormones juvéniles chez 0. moubata. De telles substances influenceraient la vitellogénèse de la femelle de façon peut-être comparable à ce qui a été montré chez les insectes. 5) Des vitellogénines apparaissent dans 1'hémolymphe de la femelle après le repas sanguin et la copulation. Ces pro- téines sont probablement synthétisées par des cellules du corps gras (DIEHL & al, 1982). Nous avons montré qu'une vitel- logénine tout"au moins subit des modifications structurales relativement importantes lors de son incorporation dans 1'ovocyte. Ces transformations portent sur le nombre de sous-unités et non seulement sur une variation de la compo- sition en lipides, comme cela a été décrit chez certains insectes (CHINO & al, 1976; CHINZEI & al, 1981). Le futur oeuf n'étant pas entouré de cellules folliculaires chez les tiques, nous pouvons supposer que les transformations chimiques des vitellogénines s'opèrent dans 1'ovocyte lui- même . 6) Des différences physiologiques et morphologiques séparent les Chélicérates des Insectes. L'anatomie d'un grand nombre d'espèces est connue depuis longtemps, mais leur physiologie est encore souvent perçue de façon fragmentaire. L'étude comparative des systèmes endocriniens régissant la vie des Arthropodes permettra, dans l'avenir, de mieux saisir les liens unissant les différents groupes entre eux. Notre travail s'est inscrit dans une telle perspective. 125 REMERCIEMENTS Je tiens tout d'abord à exprimer ma vive gratitude au professeur A. Aeschlimann, Directeur de l'Institut de Zoologie de l'Université de Neuchâtel, qui m'a proposé le sujet de ce travail et fait bénéficier de son expérience et de ses connaissances étendues en acarologie; en tant que directeur de thèse, il a corrigé mon manuscrit avec patience et compétence. Ma sincère reconnaissance va également au professeur P.A. Diehl, qui a mis à ma disposition son savoir et ses qualités de chercheur en me conseillant tout au long de ma recherche. Je lui sais gré d'avoir consenti à évaluer mon travail en tant que membre de mon jury de thèse. Mes remerciements s'adressent de même au Dr. J.L. Connat, qui a relu et corrigé mon manuscrit en ne ménageant ni son temps, ni sa peine; il a bien voulu faire partie du jury de thèse. Le professeur H. Huggel, de Genève, a accepté de mettre ses compétences à disposition pour juger de cette recherche. Je lui en suis sincèrement reconnaissant. Le Dr. M. Brossard m'a aidé à mener à bien la réalisation des tests immunologiques, ce dont je le remercie. Mme V. Fivaz, laborantine, a fait prospérer notre élevage durant plusieurs années, permettant ainsi l'exécution pratique de ce travail; je l'en remercie également. 126 Mes remerciements s'adressent de même à tous mes collègues de l'Institut de Zoologie et à toutes les personnes qui m'ont aidé, directement ou indirectement, à la réalisation de ce travail. Cette étude a pu être entreprise grâce à l'appui financier du Fonds national suisse de la Recherche scientifique, que je remercie ici de sa générosité. Pour terminer, je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à ma femme, qui s'est chargée avec soin et efficacité du travail de dactylographie et n'a pas craint d'investir son temps afin de permettre la mise au propre de ce manuscrit. 127 BIBLIOGRAPHIE AESCHLIMANN, A. (1958) Développement embryonnaire d'Ornitho- dorus moubata MURRAY et transmission transovarienne de Borrelia duttonl. Acta Tropica 15, 15-64. AESCHLIMANN, A. (1968) La ponte chez Ornithodorus moubata MURRAY. Revue suisse de Zool. 75, 1033-1039. AESCHLIMANN, A. (1976) Les tiques, leur biologie et les maladies qu'elles transmettent. Annales 1975-1976, Université de Neuchâtels Neuchâtel, Suisse, 27 pp. AESCHLIMANN, A., HECKER, H. (1967) Observations préliminaires sur 1'ultrastructure de 1'ovocyte en développement chez Ornithodorus moubata MURRAY. Acta Trop. 24, 225-243. AESCHLIMANN, A., HECKER, H. (1969) Vitellogénèse et formation cuticulaire chez l'oeuf d'Ornithodorus moubata MURRAY. ( Ixodoideai Argasidae). Etude au microscope électronique. Acarologia H, 180-192. AESCHLIMANN, A., GRANDJEAN, 0. (1973 a) Influence of natural and "artificial" mating on feeding, digestion, vitellogenesis and egg-laying in ticks (Ixodoidea). Folia Parasitological (Praha) 20, 67-74. AESCHLIMANN, A., GRANDJEAN, 0. (1973 b) Observations on fecundity in Ornithodorus moubata. MURRAY (Ixodoidea : Argasidae). Relationships between mating and oviposition. Acarologia 15, 206-217. ANDREWS, P. (1964) Estimation of the molecular weights of proteins by Sephadex Gel-Filtration. Biochem. J. 91, 222-223. ANDREWS, P. (1965) The Gel-Filtration behaviour of proteins related to their molecular weights over a wide range. Biochem. J. 96., 595-606. 128 ARTHUR, D.R. (1962) Ticks and Disease. International Series on Pure and Applied Biology, Zoology Division, vol. 9_, 445 pp. Oxford: Pergamon Press. BALASHOV, Yu., S. (1972) A translation of bloodsucking ticks (Ixodoidea). - Vectors of diseases of man and animals. Misc. Pubi., Ent. Soc. Amer. 8, 161-376. BASSAL, T.T.M., ROSHDY, M.A. (1974) Argas arboreus ! Juvenile hormone analog termination of diapause and oviposition control. Exp. Parasitol. 36_, 1, 34-39 BAUMANN, H. (1974) Die Paragoniensubstanzen von Drosophila funebris: Isolation, Struktur, Biosynthese und Wirkung. Thèse, Univ. Zürich. 69 pp. BERGOT, B.J., JAMIESON, G.C., RATCLIFF, M.A., SCHOOLEY, D.A.(1980) JH Zero: New naturally occuring insect juvenile hormone from developing embryos of the tobacco hornworm. Science 210. 336-338. BINNINGTON, K.C. (1981) Ultrastructural evidence for the endocrine nature of the lateral organs of the cattle tick Boophilus microplus. Tissue and cell. 13, 475-491. BINNINGTON, K.C, OBENCHAIN,F.D. (1982) Structure and function of the circulatory, nervous and neuroendocrine systems of ticks. In "Physiology of ticks". Editors: F.D. OBENCHAIN & R. GALUN, Pergamon Press. 351-398. BOCTOR, F.N., KAMEL, M.Y. (1976) Purification and characteri- zation of two lipovitellins from eggs of the tick, Dermacentor andersoni. Insect Biochem. 6 (3), 233-240. 129 BOULETREAU-MERLE.J. (1975) Influence de l'accouplement sur la physiologie reproductrice des femelles de Drosophila melanogaster (Meig.). Thèse, Univ. Claude Bernard, Lyon. 320 pp. BOWERS, W.S., OHTA, T., CLEERE1 J.S., MARSELLA, P.A. (1976) Discovery of insect anti-juvenile hormones in plants. Science, Wash. 193, 542-547. BREMNER, K.C. (1959) Studies on "haemixodovin", the pigment in the eggs of the cattle tick Boophilus microplus (Acarinai Ixodidae). Aust. J. Biol. Sci. 12, 263-273. BROOKS, G.T., PRATT, G.E., JENNINGS, R.C. (1979) The action of precocenes in milkweed bugs (Oncopeltus fasciatus) and locusts (Locusta migratoria)¦ Nature 281. 570-572. BURCKHARDT, J.S. (1975) Isolation und Charakterisierung von zwei Substanzen aus den männlichen Anhangsdrüsen von Drosophila melanogaster und ihre Wirkung auf virginelle Weibchen. Inaugural Dissertation. Zürich, Univ., Phil. Fak. II, Diss, von 1975. BURGDORFER, W. (1951) Analyse des Infektionsverlaufes bei Ornithodorus moubata MURRAY und der natürlichen Uebertragung von Sp. duttoni. Acta trop. 8, 193-262. BURGDORFER, W1, BARBOUR, A.G., HAYES, S.F., PETER, 0, AESCHLIMANN, A. (1983) Erythema chronicum migrans-a tickborne spirochetosis. Acta Tropica 40, 79-83. CHINO, H., YAMAGATA, M., TAKAHASHI, K. (1976) Isolation and characterization of insect vitellogenin. It's identity with hemolymph lipoprotein II. Biochim. Biophys. Acta 441. 349-353. 130 CHINZEI1 Y., CHINO, H., WYATT, G.R. (1981) Purification and properties of vitellogenin and vitellln from Locusta migratoria. Insect Blochem. 11, 1-8. CLARKE, J.T. (1964) Simplified "disc" (Polyacrylamide gel) electrophoresis. Annals New-York Academy of Sciences 428-436. DAVEY, K.G., (1965) Copulation and egg-production in Rhodnius prolixusi the role of the spermathecae. J. Exp. Biol. 42, 373-378. DAVEY, K.G. (1967) Some consequences of copulation in Rhodnius prolixus. J. Insect Physiol. 13, 1629-1636. DAVEY, K.G. (1974) Symposium on reproduction of arthropods of medical and veterinary importance. VI. Reproduction in the female of some haematophagous insects. J. Med. Ent. 11. 40-45. DEJMAL, R.K., BROOKES, V.J. (1972) Insect lipovitellin, Chemical and physical characteristics of a yolk protein from the ovaries of an insect, Leucophaea maderae. J. Biol. Chem. 247. 869-874. DHANDA, V. (1967) Changes in neurosecretory activity at different stages in the adult Hyalomma dromedarii Koch, 1884. Nature (London) 2_14, 508-509. DIEHL, P.A. (1970) Zur Oogenese bei 0. moubata MURRAY unter besonderer Berücksichtigung der Vitellogenese. Acta Trop. 2J., 301-355. DIEHL, P.A., AESCHLIMANN, A., OBENCHAIN, F.D. (1982) Tick reproduction: oogenesis and oviposition. In "Physiology of ticks". Editors: F.D. Obenchain & R. Galun, Pergamon Press, 277-350. 131 DOANE, W.W. (1973) Role of hormones in insect development. In s Developmental Systems! Insects (Ed. by Counce S.J. & Waddington CH.) 2, 291-497 Academic Press, London. EICHENBERGER, G. (1970) Das Zentralnervensystem von 0. moubata MURRAY und seine postembryonale Entwicklung. Acta Trop. 22, 15-53. EISEN, Y., WARBURG, M.R., GALUN, R. (1973) Neurosecretory activity as related to feeding and oogenesis in the fowl- tick Argas persicus (Oken). Gen. Comp. Endocrinol. 21. 331-340. ENGELMANN, F. (1959) The control of reproduction in Diploptera punctata. Biol. Bull. 116. 406-419. ENGELMANN, F. (I960). Mechanisms controlling reproduction in two viviparous cockroaches (Blattaria). Ann. N.Y. Acad. Sci. 89, 516-536. ENGELMANN, F. (1970) The physiology of insect reproduction. Pergamon Press, Oxford. FALLON, A.M., HAGEDORN, H.H., WYATT, G.R., LAUFER, H. (1974) Activation of vitellogenin synthesis in the mosquito Aedes aegypti by ecdysone. J. Insect Physiol. 20, 1815-1923. FUCHS, M.S., HISS, E.A. (1970) The partial purification and separation of the protein components of matrone from Aedes aeRvpti. J. Insect. Physiol. 16, 931-939. GABBAY, S., WARBURG, M.R. (1976) Neurosecretory activity as related to feeding, mating and oogenesis in the female cave tick, Ornithodoros tholozani. J. Insect Physiol. 22 (9). 1291-1301. 132 GABE, M. (1955) Données histologlques sur la neurosécrétion chez les Arachnides. Arch. Anat. mlcr. morph. 44, 351-383. GALUN, R.L., WARBURG, M. (1967) Studies on the reproductive physiology of the tick Ornithodoros tholozani (Laboulbéne & Mégnin): The effect of mating on oogenesis. Acta Soc. Zool. bohemoslov. 3J1, 329-334. GEIGY, R., MOOSER, H. (1955) Untersuchungen zur Epidemiologie des afrikanischen Rückfallfiebers in Tanganyika. Acta trop. 12, 327-345. GEIGY, R., HERBIG, A. (1955) Erreger und Ueberträger tropischer Krankheiten. Acta trop. Suppl. 6. GERMOND, J.E., AESCHLIMANN, A. (1977) Influence of Copulation on Vitellogenesis and Egg-laying in Ornithodoros moubata MURRAY (Ixodoideai Argasidae). Advances in Invertebrate Reproduction I, (29), 308-318. GIRARDIE, A. (1966) Contrôle de l'activité génitale chez Locusta migratoria. Mise en évidence d'un facteur gonadotrope et d'un facteur allatotrope dans la pars intercerebralis. Bull. Soc. Zool. Fr. 91, 423-439. GRAF, J.F. (1978) Copulation, nutrition et ponte chez Ixodes ricinus L. (Ixodoidea s Ixodidae)- 3e partie. Bull. Soc. Entomol. Suisse 5_1, 343-360. HAGEDORN, H.H., FALLON, A.M. (1973) Ovarian control of vitellogenin synthesis by the fat body in Aedes aegypti. Nature 244, 103-105. HAGEDORN, H.H., KUNKEL, J.G. (1979) Vitellogenin and vitellin in insects. Ann. Rev. Entomol. 24, 475-505. 133 HIGHNAM, K.C. (1965) Some aspects of neurosecretion in arthropods. Zool. Jb. (Physiol.) 71, 558-582. HIGHNAM, K.C, HILL, L. (1977) The comparative endocrinology of the Invertebrates. Ed. by E. Arnold Ltd, London. 356 pp. HINTON, H.E. (1974) Symposium on reproduction of arthropods of medical and veterinary importance. III. Accessory functions of seminal fluid. J. Med. Ent. 11, 19-25. HOOGSTRAAL, H. (1978) Biology of ticks. In: Tick borne diseases and their vectors, edited by Wilde J.K.H. Proc. Internat. Conf. (Edinburgh, September-October 1976) pp. 3-14. HOOGSTRAAL, H., AESCHLIMANN, A. (1982) Tick-Host Specificity. Bull. Soc. Entomol. Suisse 5_5, 5-32. HUIGNARD, J., QUESNEAU-Thierry, A., BARBIER, M. (1977) Isolement, action biologique et évolution des substances paragoniales contenues dans le spermatophore d'Acanthoscelides obtectus (coléoptère). J. Insect Physiol. 23(3), 351-357. JENNI, Leo (1971) Synthese und Aufnahme von Proteinen während der Vitellogenese in Ovocyten von Ornithodorus moubata MURRAY (Ixodoidea: Argasidae). Acta Tropica 28, 105-163. KARLSON P., LUSCHER M. (1959) Pheromonesi a new term for a class of biologically active substances. Nature, Lond. 183. 55-56 KHALIL, G.M., SHANBAKY, N.M. (1975) The subgenus Persicargas (Ixodoideai Argasidae: Argas). 21. The effect of some factors in the process of mating on egg development and oviposition in Argas (P.) arboreus¦ J. med. Ent. Vl, 47-51. LAEMMLI, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227. (15), 680-685. 134 LAMOTTE, M. (1971) Initiation aux méthodes statistiques en biologie. Ed. par Masson & Cie, Paris. LANDERS, M.H., HAPP, G.M. (1980) Precocene inhibition of vitellogenesis in Drosophila melanogaster. Experientia 3£, 619-620. LEA, A.O. (1972) Regulation of egg maturation in the mosquito by the neurosecretory systems the role of the corpus cardiacum. Gen. comp. Endocr. Suppl. 3_t 602-608. LEAHY, M.G., GALUN, R. (1972) Effect of mating on oogenesis and oviposition in the tick Argas persicus (Oken). Parasitology 6_5, 167-178, LEAHY, M.G., BOOTH, K.S. (1980) Precocene induction of tick sterility and ecdysis failure. J. Med. Entomol. 17, 18-21. LOWRY, O.H., ROSEBROUGH, N.J., FARR, A.L., RANDALL, B.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 19_3, 265-275. MANSINGH, A. , RAWLINS, S.C. (1977) Antigonadotropic action of insect hormone analogues on the cattle tick Boophilus microplus¦ Naturwissenschaften 64, 41. MAURER, H.R. (1971) Disc electrophoresis and related techniques of Polyacrylamide gel electrophoresis. W. de Gruyter, Berlin, 222 pp. OBENCHAIN, F.D., OLIVER, J.H., Jr. (1975) Neurosecretory System of the American Dog Tick, Dermacentor variabilis (Acari: Ixodidae). II. Distribution of secretory cell types, axonal pathways and putative neurohemal-neuroendocrine associations; comparative histological and anatomical implications. J. of Morphology 145, (3), 269-293. 135 OLIVER, J.H., Jr. (1974) Symposium on reproduction of arthropods of medical and veterinary Importance. IV. Reproduction in ticks (Ixodoidea). J. Med. Ent. 11, 26-34. OLIVER, J.H., Jr., MURPHY, R.W., OBENCHAIN, F.D. (1975) Reproduction in ticks ( Acari î Ixodoidea) . 4_^ Effects of mechanical and chemical stimulation on oocyte development in Amblyomma americanum. J. of Parasitol. 6_1, 782-784. OUCHTERLONY, 0. (1949) Antigen-antibody reactions in gels. Acta Path. Microbiol. 26, 507-515. PAPPAS, P.J., OLIVER, J.H., Jr. (1971) Mating necessary for complete feeding of female Dermacentor variabilis (Acari! Ixodidae). J. Ga. Ent. Soc. 6, 122-124. PAPPAS, P.J., OLIVER, J.H., Jr. (1972) Reproduction in ticks ( Acari ; Ixodoidea). 2. Analysis of the stimulus for rapid and complete feeding of female Dermacentor variabilis (Say). J. Med. Entomol. 9, 47-50. PENER, M.P., ORSHAN, L., De WILDE (1978) Precocene II causes atrophy of corpora aliata in Locusta migratoria. Nature 272., 350-353. POUND, J.M., OLIVER, J.H., Jr. (1979) Juvenile Hormone: Evidence of its role in the reproduction of ticks. Science, 206. 355-357. PRATT, G.E., BOWERS, W.S. (1977) Precocene II inhibits juvenile hormone biosynthesis by cockroach corpora aliata in vitro. Nature, London. 265. 548-550. PRATT, G.E., JENNINGS, R.C, HAMNETT, A.F., BROOKS, G.T. (1980) Lethal metabolism of precocene-I to a reactive epoxide by locust corpora aliata. Nature 284. 320-323. 136 ROELLER, H., DAHM, K.H., SWEELY, CC, TROST, B.M. (1967) The structure of the juvenile hormone. Angew. Chem. 6, 179-180. ROSHDY, M.A., SHOUKREY, N.M., COONS, L.B. (1973) The subgenus Persicargas (IxodoideaiArgasidae: Argas). 17. A neurohemal organ in A2-(P^) arboreus Kaiser, Hoogstraal, and Kohls. J. of Parasitol. 59 (3), 540-544. ROTH, L.M., STAY, B. (1961) Oocyte development in Diploptera punctata (Eschscholtz) (Blattaria). J. Insect. Physiol. 7, 186-202. ROTHSCHILD, L. (1961) Structure and movements of ticks spermatozoa. Quart. J. Micr. Sci. 102. 239-248. SEDMAK, J.J., GROSSBERG, S.E. (1977) A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using Coomassie Brilliant Blue G250. Analyt. Biochem. 79, 544-552. SHANBAKY, N.M., KHALIL, G.M. (1975) The subgenus Persicargas (Ixodoidea: Arsasidae: Argas). 22. The effect of feeding on hormonal control of egg development in Argas (Persicargas) arboreus. Exp. Parasit. 3_7, 361-366. SIEGEL, S. (1956) Non parametric statistics for the behavioral sciences. Internat. Student Edition/Mc-Graw-Hill, Kogakusla Ltd., Tokyo. SLAMA, K., ROMANUK, M., SORM, F. (1974) Insect hormones and bioanalogues. Springer-Verlag, Wien and New-York. SOLOMON, K.R., MANGO, CK.A., OBENCHAIN, F.D. (1982) Endocrine mechanisms in ticks: effects of insect hormones and their mimics on development and reproduction. In "Physiology of ticks". Editors: F.D. Obenchain & R. Galun. Pergamon Press, 399-438. 137 SPICKETT, A.M. (1978) Effects of b0 Co irradiation on Amblvomma hebraeum Koch, 1844 (Acarina: Ixodidae). Onderstepoort J. vet. Res. 4_5, 197-201. SPIEGEL, M.R. (1972) Statistique. Série Schaum, Ed. par Mc Graw-Hill, Paris. TATCHELL, R.J. (1971) Electrophoretic studies on the proteins of the hemolymph, saliva, and eggs of the cattle tick, Boophilus microplus . Insect Biochem. 1, 47-55. WIGGLESWORTH, V.B. (1943) The fate of haemoglobin in Rhodnius prolixus (Hemiptera) and other blood-sucking arthropods. Proc. R. Soc. Lond. (B) 131, 313-339. )38