Université de neuchâtel institut de Zoologie Modulation de l'immunité de lapins contre les tiques Ixodes ricinus L.: effets de la charge parasitaire et de traitements par les cytokines IL-2 et TNF-ct par Sandra Schorderet Licenciée en Biologie Thèse présentée à la Faculté des Sciences de l'Université de Neuchâtel pour l'obtention du grade de docteur es sciences. 1993 à Jean-Marc à mes parents IMPRIMATUR POUR LA THÈSE Modulation de 1'immunité de lapins contre .....les ..tiques. Ixodes ricinus.. L...:......elf eta..de........ .....Ia charge parasitaire et de traitements............ .....par""ie&""eytöklriöB'"iE-2'"'et""TRP-a................................... de Mademoiselle...Sandra...Schorderet.................................... UNIVERSITÉ DE NEUCHÂTEL FACULTÉ DES SCIENCES La Faculté des sciences de l'Université de Neuchâtel sur le rapport des membres du jury, MM. M. Brossard, B. Rutti, K. Pfister (Berne) et S. Martinod (Lincoln, Nebraska) autorise l'impression de la présente thèse. Neuchâtel, le .......^...août 1993......................................................... Le doyen : A. Robert Table des matières i Table pes matières 1. Introduction........................................................1 1.1. Présentation du parasite...........................................1 1.2. Les hôtes développent une résistance contre les tiques .................... 1 1.3. La peau de l'hôte, organe-cible des tiques..............................2 1.4. La piqûre des tiques provoque une inflammation locale de la peau de l'hôte.............................,.................4 1.5. La piqûre des tiques induit chez l'hôte une réponse immunologique spécifique......................................................7 1.6. Les tiques peuvent prévenir les défenses de l'hôte....................... 10 1.7. Caractérisations d'antigènes....................................... 12 1.8. Les cytokines, un nouvel outil pour comprendre et moduler la réponse immunologique d'un hôte face à un parasite................... 13 1.8.1. IL-2..................................................... 13 1.8.2. Le TNF-a, médiateur des réactions inflammatoires................. 14 1.9. Buts du travail...........:..................................... 18 2. Matériel et méthodes................................................ 19 2.1. Animaux...................................................... 19 2.1.1. Tiques................................................... 19 2.1.2. Lapins................................................... 19 2.2. Antigènes..................................................... 19 2.2.1. Extrait de glandes salivaires (EGS)............................. 19 2.2.2. Extrait tégumentaire (ET).................................... 20 2.2.3. Récolte de salive........................................... 20 2.3. Effets de la charge parasitaire sur l'acquisition de la résistance et la réponse immunitaire cellulaire et humorale du lapin ................ 21 2.3.1. Expérience préliminaire...................................... 21 2.3.2. Infestations en continu...................................... 21 2.3-3. Modulation de la réponse cellulaire et humorale du lapin par deux degrés d'infestaticn différents, et conséquences sur le développement de la résistance........................... 21 2.4. Effets d'un traitement à ITL-2 recombinante humaine sur l'acquisition de la résistance chez des lapins infestés, et sur leur réponse cellulaire et humorale contre les tiques................ 22 2.4.1. Antigène................................................. 22 2.4.2. IL-2..................................................... 22 2.4.3. Première expérience ........................................ 22 2.4.4. Expérience complémentaire................................... 23 2.5. Effets du TNF-a sur l'acquisition de la résistance et sur la réponse immunitaire des lapins infestés............................ 23 2.5.1. Antigène................................................. 23 2.5.2. TNF-a................................................... 23 2.5.3. Vaccination contre le TNF-a.................................. 23 2.5.4. Traitement des lapins au TNF-a............................... 24 2.6. Effets in vitro des antigènes de tiques sur les lymphocytes et les neutrophils de lapins indemnes ou sensibilisés par les tiques ............. 24 2.6.1. Effet sur les lymphocytes..................................... 24 2.6.2. Effet sur les neutrophiles .................................... 25 Table des matières h 2.7. Effets du sérum de lapins sensibilisés aux tiques sur la prolifération de lymphocytes d'animaux indemnes ou sensibilisés........... 25 2.8. Statistique .................................................... 25 3. Résultats et discussions.............................................. 26 3.1. Effets de la charge parasitaire sur l'acquisition de la résistance et la réponse immunitaire cellulaire et humorale du lapin ................ 26 3.1.1. Expérience préliminaire...................................... 26 3.1.1.1. Remarques générales................................... 26 3.1.1.2. Biologie des tiques.................................... 26 3.1.1.3. Sérologie........................................... 28 ¦ 3.1.2. Infestations en continu ...................................... 28 3.1.2.1. Remarques générales.................................. 28 3.1.2.2. Biologie des tiques.................................... 29 3.1.2.3. Sérologie........................................... 29 3.1.3. Commentaire intermédiaire...............'.................... 31 3.1.4. Modulation de la réponse cellulaire et humorale du lapin par deux degrés d'infestation différents, et conséquences sur le développement de la résistance................................ 31 3.1.4.1. Biologie des tiques....................................31 3.1.4.2. Réponse cellulaire des lapins: analyse par transformation lymphoblastique................ 32 3.1.4.3. Sérologie........................................... 33 3.1.5. Discussion................................................ 33 3.1.6. Conclusion................................................ 37 3.2. Effets d'un traitement à 1TL-2 recombinante humaine sur !'acquisition de la résistance chez des lapins infestés, et sur leur réponse cellulaire et humorale contre les tiques................ 37 3.2.1. Remarque générale.........................................37 3.2.2. Première expérience ........................................ 38 3.2.2.1. Effet du traitement à I'IL-2 sur la biologie des tiques.......................................... 38 3.2.2.2. Sérologie........................................... 38 3.2.2.3. Transformation lymphoblastique......................... 39 3.2.3. Considérations intermédiaires................................. 40 3.2.4. Expérience complémentaire................................... 40 3.2.4.1. Remarque préliminaire................................ 40 3.2.4.2.' Réponse cellulaire des lapins............................ 40 3.2.4.3. Biologie des tiques.................................... 42 3.2.5. Discussion................................................ 43 3.2.6. Conclusion................................................ 46 3.3. Effets du TNF-ct sur l'acquisition de la résistance et sur la réponse immunitaire des lapins infestés.......... ................. 47 3.3.1. Remarque préliminaire...................................... 47 3.3.2. Vaccination contre le TNF-a .................................. 47 3.3.2.1. Titres d'anticorps anti-TNF-o ........................... 47 3.3.2.2. Réponse humorale contre I1EGS.......................... 47 3.3.2.3. C3 sérique.......................................... 48 3.3.2.4. Réponse cellulaire des lapins: analyse par transformation lymphoblastique................ 48 3.3.2.5. Biologie des tiques....................................49 3.3.3. Remarques ...............................................49 Table des matières ìli 3.3.4. Traitement avec le TNF-a.................................... 50 3.3.4.1. Remarque préliminaire................................ 50 3.3.4.2. Réponse humorale contre I1EGS.......................... 50 3.3.4.3. C3 sérique..........................................60 3.3.4.4. Réponse cellulaire des lapins: transformation lymphoblastique .........................50 3.3.4.5. Réponse cellulaire des lapins: migration de neutrophiles.............................. 51 3.3.4.6. Biologie des tiques.................................... 51 3.3.4. Discussion................................................ 51 3.3.5. Conclusion................................................55 3.4. Effete in vitro des antigènes de tiques sur les lymphocytes et les neutrophiles de lapins indemnes ou sensibilisés par les tiques .............56 3.4.1. Remarque préliminaire...................................... 56 3.4.2. Effet sur les lymphocytes..................................... 56 3.4.2.1. EGS .............................................. 56 3.4.2.2. Salive ............................................. 57 3.4.2.3. ET................................................ 57 3.4.3. Effet sur les neutrophiles ....................................57 3.4.4. Discussion................................................ 59 3.5. Effets du sérum de lapins sensibilisés aux tiques sur la prolifération de lymphocytes d'animaux indemnes ou sensibilisés........... 61 3.5.1. Remarque................................................ 61 3.5.2. Effet sur des lymphocytes de lapins indemnes..................... 61 3.5.3. Effet sur des lymphocytes de lapins sensibilisés ................... 62 3.5.4. Discussion................................................ 62 4. Discussion générale et conclusions...................................... 64 5. RésuméB......................................................... 67 5.1. Résumé....................................................... 67 5.2. Summary..................................................... 69 Annexes ........................................................... 71 Annexe I: Infestation des lapins et récolte des tiques........................ 71 Annexe II: Prélèvement et isolation du plasma et des cellules................. 72 Annexe lu: Tests cellulaires .......................................... 74 Annexe IV: Tests sérologiques......................................... 78 Remerciements...................................................... 33 Bibliographie........................................................ 84 Introduction 1 1. Introduction 1.1. Présentation du parasite Les tiques, principalement les Ixodides, sont des ectoparasites importants de l'homme et des animaux. Certaines espèces sont directement responsables de pertes économiques substantielles dans le domaine de la production de viande, de cuir ou de laine (Steelman, 1976): soit en raison d'infestations massives, comme dans le cas de Boophilus microplus en Australie (Springell, 1983), soit à cause de substances toxiques, généralement paralysantes, contenues dans leur salive (Gothe et al, 1979), à l'exemple à'Ixodes rubicundus en Afrique du Sud (Stampa, 1959; Spickett et Heyne, 1988). Cependant, la majorité des tiques d'importance économique ou médicale le sont pour leur rôle dans la transmission de maladies. Les Ixodides sont classés au premier rang des vecteurs d'agents pathogènes pour le bétail, et se trouvent en seconde position derrière les moustiques, en ce qui concerne la transmission de parasites à l'homme (Balashov, 1972; Bram, 1975). Ixodes ricinus est la tique la plus répandue en Suisse et en Europe septentrionale. EUe colonise les milieux abrités à hygrométrie élevée (forêts, bosquets, haies) jusqu'à une altitude de 1200m (Aeschlimann, 1972). Elle parasite aussi bien les Reptiles et les Oiseaux que de nombreux Mammifères, dont l'Homme. Cette tique sert de vecteur à de nombreux pathogènes affectant les animaux domestiques: Coxiella burnetii, Babesia diver gens t ou encore Ehrlichia phagocytophila, agents respectifs de la fièvre Q (Brassard et Aeschlimann, 1976), des piroplasmoses bovines en Suisse (Aeschlimann et al., 1975), et de la fièvre de pâture (Liz et Pfister, 1989; Liz et al., 1991). Elle transmet également des microorganismes responsables de maladies humaines comme le virus de l'encéphalite à tiques (FSME; Aeschlimann et al., 1979), ou Borrelia burgdorferi, agent de la borréliose de Lyme (Burgdorfer et al., 1983). 1.2. Les hôtes développent une résistance contre lea tiques Le contact répété entre une tique et un animal aboutit très souvent à l'apparition d'une résistance de l'hôte dirigée contre la tique. Le premier rapport d'un tel phénomène date de 1918, par Johnston et Bancroft, et concerne les bovins. La résistance peut être le résultat d'une action mécanique de l'hôte sur les tiques: si Introduction 2 l'on prévient le grattage chez des bovins infestés par B. microplus, le nombre de tiques gorgées sur ces animaux augmente considérablement (Bennett, 1969). Le grattage, moyen de défense utilisé également contre d'autres ectoparasites (Murray, 1987), n'est cependant pas le composant principal de la résistance. Trager (1939), dans une étude sur des cobayes infestés par Dermacentor variabilis, met en évidence son caractère avant tout immunologique. La réponse immune (mode et intensité) peut varier considérablement suivant l'hôte et l'espèce de tiques étudiés (Ribeiro, 1989). Des phénomènes de résistance ont surtout été décrits chez des animaux domestiques (chiens, bovins, ovins), ou de laboratoire (cobayes et lapins principalement). Les effets sur les tiques sont divers. Hs peuvent se limiter à un simple rejet de l'ectoparasîte, à l'exemple des larves de B.microplus infestant des bovins de la race Bos taunts (Roberts, 1968). Cependant, dans la plupart des cas, ils provoquent de graves perturbations du cycle de vie des tiques: prolongation du temps de gorgement, diminution du poids d'engorgement, perturbations de la mue et de la ponte, diminution de la viabilité des oeufs, mort de la tique sur l'hôte. Le sujet a fait l'objet de multiples publications et de nombreuses revues (Willadsen, 1980; Wikel, 1982a, 1984; Wikel et Allen, 1982; Wikel et Whelen, 1986; Brown, 1985,1988c; Allen, 1986, 1989; Brossard et al., 1991).. 1.3, La peau de l'hôte, organe-cible des tiques Les tiques, en tant qu'ectoparasites, ne sont en contact direct avec leur hôte que sporadiquement au moment du repas sanguin, et par l'unique intermédiaire de leurs pièces buccales. Les relations tiques/hôte (besoins nutritionnels du parasite/défense de l'hôte) se déroulent au niveau de la peau. La peau des Mammifères est un organe-complexe composé de trois couches de tissus superposées (Wheater et Burkitt, 1988): a) L'épidémie C'est un epithelium pavimenteux stratifié kératinisé, dont la cellule de base est le kératinocyte. Il constitue la première barrière du corps face à l'environnement. Il est formé de plusieurs sous-couches définies d'après le degré de kératinisation des cellules. Le kératinocyte n'est pas une cellule inerte du point de vue immunologique (Küpper, 1990). H synthétise de nombreuses cytokineB (interleukine(IL)-l, IL-6 et plusieurs "colony stimulating factors" (CSF)). Par sa production d'IL-1, d'IL-6 et de GM-CSF (granulocyte macrophage-CSF), il semble seconder les cellules de Langerhans dans" leur fonction de présentation d'antigènes au niveau local en optimalisant leur environnement. Dans des conditions pathologiques, il peut lui- même exprimer des antigènes dlùstocompatibilité de classe II et pourrait fonctionner comme cellule présentatrice d'antigènes (CPA). Introduction 3 Les cellules de Langerhans, situées dans le stratum spinosum (couche moyenne), sont dérivées des cellules mésenchymateuses de Ia moelle osseuse, et participent à l'initiation de la réponse immunitaire. Ce sont avant tout des CPA. Elles expriment à leur surface des protéines du complexe dTiistocompatibilité de classe II, et peuvent sécréter de 1'IL-1. Elles ont la capacité de quitter l'épiderme, et, via la circulation lymphatique, d'aller présenter l'antigène qu'elles auront métabolisé aux lymphocytes T helper (CD4*) situés dans les ganglions lymphatiques (Unanue, 1992). Dans le stratum basale (couche profonde) se situent les melanocytes, participant à la protection du corps contre le rayonnement ultraviolet. b) Le derme C'est un tissu conjonctif fibroélastique dense non orienté, principalement composé de fibres (collagène et elastine) noyées dans une substance fondamentale (glycosaminoglycanes), le tout formant la matrice extracellulaire. H contient peu de cellules résidentes. Les fibroblasts sont responsables de la synthèse de la matrice extracellulaire. Us peuvent intervenir dans des processus immunitaires, notamment lors de réactions inflammatoires, par la sécrétion de cytokines (IL-6, transforming growth factor (TGF)-ß) ou de Prostaglandines (PG). Ces substances peuvent agir en retour sur les fibroblastes soit par l'inhibition (PG) soit par !'activation (TGF-ß, IL-I) de la synthèse de collagène. Le derme est un tissu richement vascularisé. Les cellules endotheliales des capillaires constituent une barrière entre le milieu extra- et intravasculaire. Elles peuvent sécréter des cytokines (IL-I, IL-6, IL-8, etc.) et jouent un rôle actif dans les processus d'extravasation des cellules immunitaires circulantes. Les mastocytes, présents également dans d'autres tissus conjonctifs, s'accumulent aux alentours des capillaires dermiques, dans des zones proches de l'épiderme (Siraganian, 1992). Ils produisent et répondent à différentes cytokines. Par les médiateurs contenus dans leurs granules (histamine, etc.), ils exercent un contrôle sur Ia perméabilité capillaire. Le derme comprend encore des cellules dendritiques et des macrophages tissulaires (histiocytes), éléments de défense de l'organisme. D'autres cellules faisant partie du système immunitaire sont présentes dans ce tissu, mais restent rares en conditions normales: les neutrophils et les lymphocytes T et B. Ces cellules infiltrent massivement le derme en cas d'agression externe. Enfin, c'est dans le derme que se trouvent les nombreux récepteurs sensoriels que possède la peau. c) I/hypoderme C'est un tissu conjonctif fibroélastique lâche, en continuité avec le derme. En plus des cellules mentionnées ci-dessus, il comprend un grand nombre d'adipocytes servant au stockage d'énergie (graisses), au maintient de lTioméothermie (isolant), et à la protection contre les chocs. Les annexes épidermiques (glandes sudoripares et sébacées, poils, ongles) sont insérées dans le derme et fhypoderme. Introduction 4 1.4. La piqûre des tiques provoque une inflammation locale de la peau de l'hôte Les piqûres de tiques provoquent une infiltration de cellules inflammatoires et immunitaires dans les tissus cutanés entourant le rostre des ectoparasites. L'étude séquentielle des événements cellulaires se déroulant aux sites de fixation des tiques pendant leur repas sur des hôtes indemnes ou sensibilisés donne de précieux renseignements sur les modalités de la réponse anti-tiques. Le rostre des femelles d'I.ricinus (hypostome et chélicères) pénètre profondément dans le derme des hôtes, allant jusqu'à percer le cartilage sous-jacent d'une oreille de lapin (Brossard et Fivaz, 1982). Dès le premier jour d'une primo- ou d'une réinfestation, des mastocytes proches du site de fixation dégranulent. Bs sont plus nombreux à dégranuler en réinfestation, alors que leur nombre total dans la lésion ne varie pas (Brossard et Fivaz, 1982). Abdul-Amir et Gray (1987) et Mbow et al. (1993a) obtiennent des résultats similaires chez des moutons et des souris infestés par !.ricinus (adultes et nymphes respectivement), de même que GiIl et Walker (1985) et GiIl (1986), pour des lapins et des bovins infestés par des adultes de Hyalomma anatolicum anatolicum. La participation des mastocytes à la résistance anti-tiques semble dépendre du modèle étudié. Des souris BALB/c infestées à plusieurs reprises par des larves de D.variabilis deviennent résistantes dès la troisième infestation (DenHollander et Allen, 1985a). Des biopsies prélevées aux sites de fixation révèlent la présence massive de mastocytes et d'éosinophiles, dont un grand nombre sont dégranulés. Par contre, ces mêmes souris ne développent pas de protection contre des nymphes de I.ricinus (Mbow et al., 1993a). Des soutîb déficientes en mastocytes (WBBeF/J-W/W), infestées par des larves de Haemaphysalis longicornis, ne deviennent pas résistantes (Matsuda et al., 1985; 1990). Par contre, ces mêmes souris le sont contre des larves de D.variabilis (DenHollander et Allen, 1985b; Steeves et Allen, 1991). L'immunité acquise dans ce cas semble associée à la présence et à l'activité de basophiles (Steeves et Allen, 1990). Même si l'intervention des mastocytes dans les phénomènes de résistance n'est pas vraiment prouvée, ces cellules participent certainement aux réactions inflammatoires générées par la piqûre des tiques. En primoinfestation, ces cellules peuvent dégranuler sous l'effet d'une agression physique due au rostre, ou biochimique due à des esterases saiivaires (Gegzy et al., 1971; GiIl et al., 1966; Willadsen et al., 1987), ou à des anaphylatoxines comme le C5a, libérées sous l'action de la salive des tiques (Berenbergef al., 1972). En réinfestation, la dégranulation des mastocytes dépendrait plutôt de la présence d'anticorps IgE spécifiques d'antigènes ectoparasitaires. H existe plusieurs sous-populations de mastocytes, différenciables d'après leur apparence microscopique, leur localisation dans l'organisme et les médiateurs qu'ils produisent (Siraganian, 1992). La majorité des cellules se trouvant dans le derme sont deB mastocytes des tissus conjonctifs (par opposition aux mastocytes muqueux). Ils libèrent des médiateurs tels que !!«stamine, qui augmente la perméabilité vasculaire et qui est chimiotactique pour les eosinophiles; l'héparine, à l'action rf-> !f->?f->!f ? * ? ¦= Introduction 5 anticoagulante; un "eosinophil chemotactic factor of anaphylaxis" (ECF-A); ainsi que diverses proteases et des produits du métabolisme de l'acide arachidonique {figure 1), dont la PGD3, un puissant vasodilatateur et bronchoconstricteur (VanArsdel, 1992; Siraganian, 1992). Les mastocytes produisent également des cytokines, dont le tumor necrosis factor (TNF)-ct (Gordon et al., 1990). Contrairement aux autres cellules sécrétrices de TNF-a, les mastocytes sont les seuls à stocker la cytokine préformée dans des granules. Activés, Us sont capables de la libérer très rapidement dans le milieu (Gordon et Galli, 1990). Le TNF-a des mastocytes semble être responsable d'une augmentation de la migration des neutrophiles vers les sites inflammatoires (Zhang et al., 1992), par un effet chimiotactique direct (Rampart et al., 1989), ou en augmentant l'expression des molécules d'adhésion membranaire spécifiques (Vassalli, 1992) et la synthèse d'IL-8 par les cellules endotheliales (Rot, 1992). Dès le début de !'infestation chez les espèces d'hôtes habituellement étudiées, de nombreux leucocytes infiltrent le derme entourant les pièces buccales de la tique. Chez les lapins infestés par !.ricinus, les sites de fixation sont envahis par des neutrophiles dès le premier jour d'une primo- ou d'une réinfestation (Brassard et Fivaz, 1982). Au troisième jour du repas sanguin, une cavité est observée sous les pièces buccales des tiques. Cette lésion, trop importante pour être due uniquement à une activité cytolyüque de la salive, serait le résultat de la réaction inflammatoire développée par l'hôte. En libérant leurs enzymes hydrolytiques, les neutrophiles sont responsables de la formation de telles cavités chez des chiens infestés par Rhipicepkalus sanguineus (Tatchell et Moorhouse, 1970). Les neutrophiles sont le composant majeur de l'infiltrat cellulaire, en primo- et en réinfestation, ce qui est également vrai dans de nombreux autres modèles: lapins infestés par Amblyomma variegatura, Rhipicepkalus appendiculatus (Walker et Fletcher, 1986; Latif et al., 1990) ou H.a.anatolicum (GiIl et Walker, 1985); moutons parasités par !.ricinus (Abdul-Amir et Gray, 1987); bovins par B. microplus (Tatchell et Moorhouse, 1968) ou par H.a.anatolicum (GiIl, 1986); souris infestées par Ornithodoros talaje (Need et al., 1992). L'arrivée massive, précoce et non-spécifique des neutrophiles suppose la libération, aux sites de fixation des tiques, de facteurs cbimiotactiques pour ces cellules: C5a généré par la salive des tiques (Berenberg et al., 1972, Gordon et Allen, 1991a), TNF- a produit par les mastocytes, les macrophages ou les kératinocytes (Vassalli, 1992), ou IL-8 libérée par les cellules endotheliales, les fibroblastes ou les kératinocytes (Zachariae et Matsushima, 1992). Les neutrophiles en place produisent également des médiateurs facilitant leur infiltration (Lloyd et Oppenheim, 1992): TNF-a, leukotriène (LT)B4 (chimiotactique puissant pour les neutrophiles). En réinfestation, l'activation du système complément et la libération de C5a pourrait provenir de la formation, au niveau de la lésion, de complexes antigènes-anticorps. Une étude par immunofluorescence indirecte met en évidence la présence d'antigènes salivaires, d'anticorps spécifiques et de complément autour des sites de fixation de larves de Dermacentor andersoni sur des cobayes (Allen et al., 1979a). Introduction 6 C'est en réinfestation que les basophiles envahissent généralement les sites de fixation des tiques. Chez les cobayes, la résistance à diverses espèces comme D.andersoni (Allen, 1973) ou Ixodes kolocyclus (Brown et al., 1984a) est étroitement liée à l'infiltration massive des basophiles. L'immunité contre Amblyomma americanum est d'ailleurs fortement diminuée si l'on traite les cobayes avec un sérum anti-basophiles (Brown et ai., 1982). Des bovins infestés par A.americanum (Brown et al., 1984b) ou I.kolocyclus (Allen et al., 1977) présentent le même type de réponse. Ces animaux développent de fortes réactions d'hypersensibilité retardée à basophiles (Jones-Mote) en réponse à l'injection d'antigènes de tiques. Comme dans le cas d'une hypersensibilité retardée de type tuberculinique, ces réactions sont initiées par des lymphocytes T qui reconnaissent spécifiquement les antigènes injectés (Benjamini et Leskowitz, 1991). Des IgG (Brown et Askenase, 1983), ou d'autres composants sériques (IgE, complément) semblent également participer au phénomène. Dans d'autres modèles, bovins infestés par H.a.anatolicum (GiIl, 1986), moutons par I.ricinus (Abdul-Amir et Gray, 1987), ou lapins par H.a.anatoliculum (GiU et al., 1985) ou I.ricinus (Brossard et Fivaz, 1982), le nombre de basophiles infiltrants s'accroît considérablement en réinfestation. Ils ne constituent toutefois au maximum que le dixième des cellules présentes, la majorité étant composée de neutrophiles et de cellules mononucléaires. Néanmoins, les basophiles semblent également participer aux phénomènes de résistance dans ces modèles: au cours de réinfestations avec I.ricinus, le nombre de basophiles dégranulés autour des sites de fixation dans la peau des lapins augmente progressivement (Brossard et Fivaz, 1982). De plus, le nombre de basophiles circulants sensibilisés et dégranulant au contact d'un extrait de glandes salivaires de femelles partiellement gorgées s'accroît à chaque nouvelle infestation (Brossard et al., 1982). Les basophiles, comme les mastocytes, libèrent de !"histamine qui perturbe la biologie des tiques. Chez des bovins infestés par B.microplus, les larves se détachent prématurément de leur hôte quand cette amine est injectée juste sous leur rostre (Kemp et Bourne, 1980). Les auteurs obtiennent le même résultat avec des tiques nourries artificiellement sur membrane. Par contre, d'autres substances augmentant la perméabilité vasculaire telles que bradykinine, PGE3 ou dopamine, n'ont que peu d'effets. Willadsen et al. (1979) soulignent l'importance de rhistamine dans les mécanismes de défense contre les tiques. Ils associent sa concentration dans la peau de bovins et l'intensité des réactions d'hypersensibilité immédiate, avec le degré de résistance contre B.microplus. L'inoculation à des cobayes d'antagonistes des récepteurs histaminiques H1 et H2 inhibe l'expression de la résistance contre des larves de D.andersoni (Wikel, 1982b). Les lapins infestés par I.ricinus développent entre autres des réactions d'hypersensibilité immédiate (Girardin et Brossard, 1985). Un traitement de ces animaux en réinfestation avec de la mépyramine, un antihistaminique bloquant les récepteurs H1 (Pearce, 1992), abaisse leur résistance (Brossard, 1982). La diminution de la perméabilité vasculaire causée par la drogue freinerait l'exsudation de facteurs humoraux (anticorps spécifiques ou complément) et l'infiltration des cellules inflammatoires et immunitaires dans les sites de fixation. Introduction 7 LTiistamine exerce une action directe sur la physiologie des ectoparasites. Les processus de nutrition et de salivation, mesurés par électrophysiologie chez D.andersoni, sont gravement perturbés par ce médiateur (Paine et al., 1983). LTiistamine peut aussi agir indirectement contre les tiques par les démangeaisons qu'elle provoque dans la peau de l'hôte, entraînant le grattage (Koudstaal et al., 1978). Attirés par lliistamine, FECF-A produit par les mastocytes, le C5a ou dès complexes antigènes-anticorps, les eosinophiles sont aussi présents dans les sites de fixation des tiques. Leur nombre croît en réinfestation, laissant supposer un rôle actif de ces cellules dans l'immunité anti-tiques (Brossard et Fivaz, 1982; Brown et al., 1984b; GiIl et Walker, 1985; Walker et Fletcher, 1986; Abdul-Amir et Gray, 1987). Chez des bovins infestés par B.microplus (Schleger et al., 1976) ou des lapins par R.appendiculatus (Fivaz, 1990), les réactions d'hypersensibilité retardée sont caractérisées par une eosinophilic cutanée plutôt que par une basophilie. Brown et al. (1982), après traitement de cobayes avec des sérums spécifiques anti-basophiles et anti-éosinophiles, présentent l'immunité acquise contre A.americanum comme le résultat d'une coopération entre ces deux types de leucocytes. Les eosinophiles produisent différentes substances pouvant perturber le repas sanguin des tiques, comme la protéine basique majeure, toxique pour un grand nombre de microorganismes dont les Schistosomes (Roitt et al., 1985), différentes enzymes lytiques, et des metabolites toxiques de l'oxygène. Ils sécrètent aussi des dérivés lipidiques pharmacologiquement actifs comme les LTC4 et LTD4, les PGE1 et PGE1 (contrôle de la perméabilité vasculaire), et le platelet activating factor (PAF, chinùotactique et activateur pour de nombreuses cellules inflammatoires) (Silberstein, 1992). Leur rôle reste cependant mal défini, car ils produisent aussi une histaminase, ce qui pourrait diminuer l'intensité des réactions d'hypersensibilité immédiate développées par les hôtes (Brossard et Fivaz, 1982; Roitt et al., 1985). 1.5. La piqûre dea tiques induit chez l'hôte une réponse immunologique spécifique La présence de nombreux lymphocytes et macrophages dans le derme entourant le rostre des tiques, ainsi que plusieurs phénomènes immunologiques décrits jusqu'à présent, font supposer l'établissement d'une réponse spécifique de l'hôte contre les tiques, complétant les défenses non-spécifiques. L'immunité à médiation humorale est une des composantes de cette réponse spécifique. Trager (1939), le premier chercheur à démontrer la nature immunologique de la résistance anti-tiques, transfère à des cobayes indemnes une protection partielle contre D. variabilis en leur injectant du sérum d'animaux résistants. L'importance des anticorps dans l'acquisition de la résistance est confirmée par Wikel et Allen (1976b) par un traitement de cobayes avec du cyclophosphamide, un immunosuppresseur cytostatique. Lorsque la substance est administrée aux hôtes avant une réinfestation avec D.andersoni, l'expression de la résistance est partiellement inhibée. La Introduction 8 concentration de cyclophosphamide utilisée dans cette expérience épuise presque complètement les zones à cellules B des ganglions lymphatiques (follicules lymphoïdes et centres germinatifs à la jonction corticc-médullaire) alors que les zones à cellules T (zone paracorticale) sont nettement moins affectées. Grâce à deux injections d'immunsérum, des lapins indemnes acquièrent une résistance partielle contre I.ricinus (Brossard, 1977). Le poids d'engorgement des tiques nourries sur les lapins traités est diminué d'environ 25%. En plus de la nutrition, la ponte est également perturbée (Brossard et Girardin, 1979): seul 55% des tiques pondent, contre 94% pour celles nourries sur les animaux témoins. Le transfert d'immunsérum à des animaux indemnes a été répété dans d'autres modèles, bovins infestés par B.microplus (Roberts et Kerr, 1976), cobayes par Aamericanum (Brown et Askenase, 1981) ouR.sanguineus (Brown et al., 1983), avec comme résultat une protection partielle des animaux traités. H existe cependant des exceptions, cobayes infestés par D.andersoni, lapins par R.appendiculatus, où l'injection d'immunsérum n'induit pas un développement de résistance chez les animaux receveurs (Wikel et Allen, 1976a; Fivaz, 1990). Plusieurs études montrent que les anticorps avalés avec le sang de l'hôte conservent leurs propriétés immunologiques dans l'intestin, puis dans l'hémocoele des tiques. Chez des femelles adultes de l'espèce D.andersoni nourries pendant cinq jours sur des lapins ou des rats, ou artificiellement avec du sérum humain ou de lapin, les anticorps ingérés traversent la paroi intestinale de la tique et paraissent intacts dans lliémolymphe (Ackerman et al., 1981). Des hémolysines retrouvées dans lTiémolymphe de femelles d'I.ricinus après gorgement sur des lapins immunisés contre des globules rouges de mouton, conservent leur activité lytique (Brossard et Rais, 1984). Dans cette expérience, la concentration d'IgG dans lTiémolymphe des tiques dépend du titre d'anticorps du sang de l'hôte. Elle est plus élevée lors de réinfestatàons, alors que les lapins ont développé une résistance. D'autre part, 30 à 44% des IgG présentes dans le sérum de lapins immunisés avec de l'ovalbumine sont retrouvées intactes dans lTiémolymphe de Hyalomma excavatum et R.$anguineus après vingt-quatre heures de repas sanguin (Ben-Yakir, 1989). Les anticorps pourraient ainsi interférer directement avec le métabolisme de la tique, en se fixant aux organes internes de l'hémocoele. Dans les sites de fixation des tiques, les anticorps peuvent se complexer aux antigènes contre lesquels ils ont été produits et activer le système complément par la voie classique. Des cellules inflammatoires (neutrophiles, macrophages, basophiles, eosinophiles) seraient ainsi attirées localement (Gallin, 1989). La voie alterne d'activation participe également à l'immunité anti-tiques. Des cobayes traités avec du facteur de venin de Cobra, un inhibiteur de cette voie, présentent une moins bonne résistance contre des larves de D.andersoni (Wikel et Allen, 1977), alors que des animaux déficients en C4 développent une réponse normale (Wikel, 1979). La concentration de C3 mesurée dans le sérum de lapins infestés par I.ricinus augmente pendant le repas sanguin (Papatheodorou et Brossard, 1987). Elle est aussi plus élevée lors de réinfestations, ce qui influence le contenu en C3 de l'intestin des tiques nourries sur ces animaux. D'après ces auteurs, le complément, activé par des Introduction 9 complexes antigènes-anticorps, pourrait perturber la physiologie de la digestion de l'hémoglobine en endommageant l'épithélium intestinal des ectoparasites. L'immunité à médiation cellulaire est l'autre composante spécifique de la résistance. Par transfert de cellules de ganglions lymphatiques de cobayes résistants à des larves de D.andersoni, Wikel et Allen (1976a) obtiennent la protection partielle des animaux receveurs. Les résultats sont similaires avec des cellules d'exsudats péritonéaux de cobayes infestés par R. sanguineus (Brown et Askenase, 1981), A. americanum (Brown, 1982), I.kolocyclus ou R.appendiculatus (Askenase et ai, 1932). L'hypothèse d'une contribution de l'immunité à médiation cellulaire aux phénomènes de résistance est renforcée par la présence, dans de nombreux modèles, de fortes réactions d'hypersensibilité retardée de type tuberculinique (HRT). De telles réactions sont constatées chez des cobayes sensibilisés par D.andersoni, après une injection intradermique d'un extrait de glandes salivaires (Wikel et al., 1978). Les lymphocytes des animaux infestés répondent aussi à cet antigène dans un test de transformation lymphoblastique. Des observations similaires in vivo (test cutané) et in vitro (transformation lymphoblastique) sont rapportées avec des bovins infestés par D.andersoni (Wikel et Osbum, 1982) ou B.microptus (Opdebeeck et DaIy, 1990). Les réactions d*HRT, mesurées chez des lapins infestés par I.ricinus après une injection intradermique de 50 ug d'extrait de glandes salivaires, sont beaucoup plus fortes lors de réinfestations (Girardin et Brassard, 1985). Un traitement des hôtes avec de la cyclosporine A, un inununosuppresseur agissant spécifiquement sur les lymphocytes T (Thomson et al., 1986), provoque une diminution des réactions d*HRT (Girardin et Brassard, 1989), et une atténuation des effets de la résistance sur la biologie de3 tiques (Girardin et Brassard, 1990). Des lapins traités avec un sérum spécifique anti- thymocytes ne développent pas d'immunité contre Rfiipicephalus evertsi evertsi (Njau, 1989). La réponse en anticorps et les réactions d"HKT, mesurées chez ces animaux, sont beaucoup plus basses que chez les témoins. Le rôle des cellules T dans l'immunité anti-tiques est encore mal connu. Il commence à être étudié au niveau local grâce à des anticorps spécifiques permettant de reconnaître des sous-populations de cellules, et les cytokines qu'elles produisent. Parmi les cellules infiltrant les sites de fixation de nymphes de l'espèce I.ricinus sur des souris BALB/c, une quantité croissante de cellules T CD4* est observée, alors que le nombre de T CDS+ reste constant (Mbow et al., 1993b). L'expression des antigènes dlustocompatibilité de classe II sur les cellules mononucléaires infiltrantes augmente en réinfestation. Les cellules de Langerhans pourraient capter les antigènes salivaires injectés dans l'épiderme des cobayes infestés par des larves de D.andersoni (Allen et ai., 1979b). Dans ce modèle, ces cellules seraient responsables de Ia présentation des antigènes aux lymphocytes spécifiques (Nithiuthai et Allen, 1985). Elles seraient indispensables à l'acquisition et à l'expression d'une immunité anti-tiques (Nithiuthai et Allen, 1984). * = a g Introduction io 1.6. Les tiques peuvent prévenir les défenses de l'hôte Les Ixodides ont besoin de sang à chaque étape de leur cycle de vie. A la difficulté de trouver un hôte adéquat s'ajoutent plusieurs problèmes liés à la durée de leur repas sanguin (Ribeiro, 1987a): soit la recherche d'un endroit favorable sur l'hôte pour se fixer à l'abri du grattage; puis les phénomènes de coagulation rendant tout prélèvement de sang impossible; l'inflammation de la peau due à l'agression mécanique du rostre et chimique de la salive. Enfin, les tiques doivent faire face à la réponse immunologique de leur hôte. La salive des tiques est un composé protéique complexe les aidant à résoudre bon nombre de ces problèmes, mais elle constitue également la source principale d'immunogènes. Pour toutes ces raisons, la salive a fait l'objet de nombreuses recherches (Bînnington et Kemp, 1930). Des études biochimiques y ont mis en évidence un arsenal d'enzymes: esterases (Gegzy et al, 1971; Willadsen et al., 1987), hydrolases, lipases, aminopeptidases chez B.microplus (Schleger et Lincoln, 1976); esterases chez D.andersoni (Gordon et Allen, 1987); phosphatases acides, aminopeptidases et esterases non spécifiques chez H.a.anatolicum (GiIl et al., 1986; GiU et Walker, 1988). La salive de B.microplus contient un inhibiteur d'enzymes protéolytiques (trypsine, chymotrypsine et plasmine) inactivant le complément et le système de coagulation du sang (Willadsen et Riding, 1979,1980). Les propriétés anticoagulantes de la salive ont été démontrées chez d'autres espèces. Ainsi, un extrait de glandes salivaires de D.andersoni inhibe les systèmes intrinsèque et extrinsèque de la coagulation (figure 2) dans du sang de lapin (Gordon et Allen, 1991b). L'activité est maximale lorsque les glandes proviennent de tiques pesant au moins 250mg, et serait dirigée principalement contre les facteurs V et VII. Elle n'affecterait pas les facteurs II ou X. Lìmo et al. (1991) isolent de la salive de Happendiculatus une protéine de 65 kDa inhibant l'étape de coagulation contrôlée par le facteur Xa. Les sécrétions salivaires de !.ricinus contiennent un inhibiteur de la thrombine, caractérisé et appelé ixine par Hoffmann et al. (1991). D'autres espèces encore, citées dans la revue de Binnington et Kemp (1980), montrent des aptitudes semblables. La salive des tiques contient des vasodilatateurs permettant d'augmenter le flux sanguin dans la zone de nutrition. La PGE2 a été décrite chez B.microplus (Dickinson et al., 1976; Higgs et al., 1976), I.dammini (Ribeiro et al., 1985) et Aamericanum (Ribeiro et al., 1992). I.dammini produit un autre vasodilatateur, la prostacycline (PGI3) (Ribeiro et al., 1988), qui est aussi un inhibiteur de la coagulation sanguine (Machin, 1992). Chez R. sanguineus, les extraits de glandes salivaires montrent plutôt des propriétés tendant à limiter la perméabilité vasculaire, puisqu'ils possèdent une activité antihistaminique (Chinery et Ayitey-Smith, 1977). La présence d'un tel principe dans la salive des tiques est surtout importante pour son rôle antiinflammatoire, servant à contrebalancer les effets allergéniques d'autres Introduction 11 composés. Des allergènes ont d'ailleurs été isolés chez B.microplus (Willadsen et al., 1978) et ï.kolocyclus (Gauci et al., 1988). La salive la plus étudiée et la mieux connue est sans nul doute celle de I.dammini. Ribeiro et al. (1985) ont mis en évidence ses propriétés antihémostatiques, antiinflammatoires et immunosuppressives. L'activité antihémostatique est due à l'action conjuguée d'une apyrase, de la PGE3 et de la PGI1. Elle se caractérise par une inhibition de la voie intrinsèque de la cascade de coagulation avant l'activation du facteur X (prévenant la formation de thrombine), et par un blocage de l'agrégation des plaquettes sanguines. L'apyrase, en convertissant l'ATP en AMP, préviendrait les réactions inflammatoires consommant de l'ATP, telles que Ia dégranulation des mastocytes, inhibée également par la PGE3 (Bach, 1982), et l'agrégation des neutrophiles. Les propriétés antiinflammatoires de cette salive proviennent aussi de sa capacité de détruire des substances comme la bradykinine, qui augmente la perméabilité vasculaire et provoque la douleur, et les anaphylatoxines C3a ou C5a issues de !'activation du système complément (Ribeiro et Spielman, 1986). Il convient de remarquer ici que la salive d'autres espèces de tiques serait plutôt génératrice d'anaphylatoxines (Berenberg et al., 1972; Gordon et Allen, 1991a). La salive d'I.dammini contient une activité bloquant Ia voie alterne du complément (Ribeiro, 1987b). Une molécule de 49 kDa est responsable de l'inhibition du clivage du C3 en C3a et C3b et de la fixation du C3b sur une surface acüvatrice. Les propriétés immunosuppressives de la salive de I.dammini ont été démontrées dans un test in vitro utilisant un hybridôme de cellules T (Ribeiro et al., 1985). L'activation et la prolifération des cellules sont inhibées par la suppression de la production d'IL-2. Des résultats similaires sont obtenus in vitro avec la salive de D.andersoni (Ramachandra et Wikel, 1992). Les auteurs observent aussi une inhibition des synthèses d'interféron (INF)-T par les lymphocytes, et de TNF-cc par les macrophages. La PGE3 est vraissembiablement à l'origine de ces effets immunosuppresseurs (Ribeiro, 1987a). Ce dérivé du métabolisme de l'acide arachidonique, également sécrété par des cellules de l'hôte se trouvant en périphérie des sites de fixation des tiques (macrophages, fîbroblastes, neutrophiles, etc), est responsable de multiples activités. La PGE1 bloque Ia sécrétion d'IL-2 et d'INF-t par les lymphocytes (Walkerei ai., 1983; Phippse* al., 1991). Bien que sa synthèse puisse être induite par le TNF-a, elle inhibe la production de cette cytokine chez les macrophages (Pettipher et Whittle, 1992) et les lymphocytes,? (Ferreri et ai, 1992). La PGE3 contrôle l'infiltration des cellules T au niveau des sites de fixation des tiques en inhibant l'adhésion des lymphocytes aux cellules endotheliales, première étape du processus d'extravasation (To et Schrieber, 1990), ce qui pourrait perturber indirectement le développement de la réponse immunitaire. Les récentes recherches démontrant l'existence, chez les souris et les humains, de deux clones distincts de cellules T helper (ThI et Th2) ont quelque peu atténué la connotation exclusivement immunosuppressive de la PGE3. Les ThI synthétisent de riL-2 et de VINF-t, et sont à l'origine de l'activation des macrophages et des réactions Introduction 12 dlïRT. Les Th2 sécrètent plutôt de l'IL-4, de l'IL-5 et de l'IL-10. us induisent la production d'IgGt et d'IgE par les lymphocytes B, et génèrent des phénomènes d'éosinophilie et des réactions d'hypersensibilité immédiate (Romagnani, 1992). La FGE1 inhibe uniquement la fonction des ThI1 favorisant ainsi la réponse immunitaire dépendant des Th2 (Betz et Fox, 1991). Ces résultats amènent à considérer la PGE3 comme une substance immunorégulatrice (Phipps et al, 1991). Mais ce nouvel aspect de la fonction de la PGE2 ne semble pas particulièrement favorable aux tiques. Enfin, certaines tiques possèdent un dernier atout pour faciliter leur repas sanguin, l'immobilisation de leur hôte par paralysie. La salive de nombreuses espèces contient des toxines paralysantes leur permettant de se nourrir en évitant d'être rejetées par grattage (Gothe et al, 1979; Vih'oen et al., 1986). 1.7. Caractërisations d'antigènes Comme nous l'avons mentionné dans le chapitre précédent, la salive est une source très importante d'antigènes contre lesquels l'hôte va diriger sa réponse immunitaire. De nombreuses études visant à répertorier et à caractériser des antigènes salivaires reconnus par les sérums d'animaux infestés ou vaccinés ont été effectuées (Brown et Askenase, 1986; GiIl et al, 1986; Shapiro et al., 1987; Brown, 1988a, 1988b; Jaworski et al., 1990, Barriga et al., 1991, Janse van Vuuren et al., 1992). Dans le cadre d'expériences de vaccination, d'autres organes comme l'intestin ont aussi été examinés, et certains antigènes caractérisés (Willadsen et al, 1989; Wong et Opdebeeck, 1989). Récemment, une protéine antigénique de 25 kDa été mise en évidence dans le tégument A'I.ricinus (Rutti et Brassard, 1989). Les animaux ayant acquis une forte résistance après des infestations répétées possèdent aussi des taux d'anticorps élevés contre cette protéine (Bovet, 1987). Par immunoblotting, de faibles quantités de 25kDa sont détectées dans un extrait total de nymphes gorgées, ainsi que dans la glande salivaire et l'hémolymphe des adultes. Cette protéine est principalement localisée dans le tégument, au niveau des cellules hypodermiques et dans la cuticule de l'alloscutum (Haug et al, 1988, Rutti et al, 1988b). Dans la glande salivaire, elle est essentiellement située dans la partie cuticulaire des canaux salivaires dés acini de type II et III (Brossard et al, 1991). Les lapins produisent des anticorps contre cette protéine (Bovet, 1987; Rutti et al, 1988a), qui semblent intervenir dans l'inhibition partielle de sa biosynthèse et de sa déposition dans le tégument (Rutti et al, 1990; Rutti et al, 1992). Un développement altéré du tégument serait ainsi une des causes de la diminution du volume sanguin prélevé par des tiques nourries sur des lapins résistants. Introduction 13 1.8. Lea cytokines, un nouvel outil pour comprendre et moduler la réponse Immuoologique d'un hôte face à un parasite Lea premiers essais de modulation de la réponse immunologique dans le modèle tique ont été effectués à l'aide de substances immunosuppressives plus ou moins spécifiques d'un compartiment du système immunitaire de l'hôte. L'utilisation de cyclosporine A (Girardin et Brossard, 1989; 1990), qui inhibe la production d'IL-2 par les lymphocytes T helper (Thomson et al., 1986), a mis en évidence l'importance de la réponse cellulaire dans le développement d'une immunité anti-tiques et le rôle potentiel de l'IL-2 en tant qu'initiateur de cette réponse. " 1.8.1. IL-2 L'IL-2 humaine est une glycoprotéine d'environ 15 kDa et de 133 acides aminés (Rosenberg et ai, 1984). Elle possède 65 à 70% d'homologie avec l'IL-2 d'autres espèces de Mammifères (souris, rat, bovin ou mouton), dont font partie les séquences d'acides aminés impliquées dans la liaison avec le récepteur. Les cellules productrices sont principalement les lymphocytes T activés (Delves et Roitt, 1992). Cette lymphokine joue un rôle central dans Tactivation des lymphocytes T et B et des macrophages. Elle est indispensable au déclenchement de l'expansion clonale rapide des cellules après contact avec un antigène ou un mitogene (Swain, 1991), et participe à leur différenciation et au développement de leurs fonctions effectrices. Elle stimule l'activité des lymphocytes T cytotoxiques (Farrar et al., 1981), des cellules NK (natural killers) (Hefeneider et al., 1983) et peut générer des cellules LAK (lymphokine activated killers) (Rosenberg, 1988). La réponse des NK à l'IL-2 se traduit par une prolifération, une production d'INF-i, et une activité cytolytique amplifiée. Chez les monocytes, la sécrétion d'IL-1 (Delves et Roitt, 1992) et de TNF-a sont déclenchées par la lymphokine (Economou et al., 1989, Remick et al., 1991); la cytotoxiaté, la phagocytose (Malkovski et al., 1987), ainsi que l'expansion des précurseurs cellulaires (Delves et Roitt, 1992) sont augmentées. Enfin, l'IL-2 accroît les réactions dTïRT (Zaloom et al., 1991) et peut annuler l'effet suppresseur de la cyclosporine A (Wang et al., 1982). A cause de son action sur les cellules LAK et sur les lymphocytes cytotoxiques, l'IL-2 a été utilisée avec quelque succès dans des thérapies contre le cancer (Rosenberg, 1988; Rees et Wiltrout, 1990), ou dans la lutte contre des infections microbiennes intracellulaires comme la lèpre (Kaplan et al., 1989) ou les leishmanioses cutanées (Akuffo et al., 1990). Malheureusement, les traitements avec des doses élevées de lymphokine provoquent souvent des effets secondaires indésirables tels que violentes fièvres, nausées, hypotension, oedèmes, problèmes rénaux et dermatologiques aigus (Dummer et al., 1991). Bon nombre de ces symptômes sont dus à l'augmentation systémique de la sécrétion de TNF-a, induite par l'IL-2. Les neutrophiles et le complément sont également impliqués dans les dommages occasionnés aux cellules Introduction 14 endotheliales et dans les problèmes de perméabilité vasculaire et d'hypotension qui en résultent (Baars et al., 1992). Des études récentes ont fait part de l'emploi de 11L-2 en tant qu'adjuvant dans des expériences de vaccination, ouvrant ainsi de nouveaux débouchés dans l'utilisation clinique de cette lyrophokàne. Des essais d'immunisation contre les virus de la rage (Nunberg et al., 1989) ou de l'herpès (Hughes et al., 1991), contre les bactéries Haemophilus pleuropneumoniae (Anderson et al., 1987) et Pseudomonas aeruginosa (Abraham et Shah, 1992), ou contre Trypanosoma cruzi (Choromanski et Kuhn, 1987) montrent que l'IL-2 amplifie la réponse immunitaire des animaux contre les pathogènes. Cette protection est principalement corrélée avec une augmentation de l'immunité à médiation cellulaire des hôtes, parfois accompagnée d'une stimulation de la réponse humorale. 1.8.2. Le TNF-oc, médiateur des réactions: inflammatoires Le TNF-a est une protéine de 154 à 157 acides aminés selon l'espèce (homme, souris, lapin) et d'environ 17 kDa, issue d'un précurseur comprenant 70 à 80 acides aminés de plus. Il n'est pas glycosylé, à l'exception du TNF-a de souris qui possède un site de glycosylation n'intervenant pas dans l'activité biologique de la molécule. Il existe environ 80% d'homologie entre les TNF-a humain, murin et de lapin, ce qui se traduit par une réactivité interspécifique élevée (Warren, 1990). Cette protéine possède également 20% d'homologie avec le TNF-ß ou lymphotoxine, qui se lie aux mêmes récepteurs et induit des réponses biologiques similaires (Cerami et Beutler, 1988). L'hormone active est un trimère où les molécules de 17 kDa sont combinées de façon non-covalente (Beutler et Cerami, 1989). Le TNF-a a tout d'abord été connu pour son action cytolytique in vitro sur différentes lignées de cellules cancéreuses et sa capacité d'induire in vivo des nécroses hémorragiques dans des tumeurs de souris (Old, 1985). H s'est révélé plus tard être identique à la cachectine (Beutler et al., 1985a), facteur à l'origine des phénomènes de cachexie (fort amaigrissement résultant d'une diminution de la masse graisseuse et musculaire, et d'une anorexie), et de chocs septiques (Cerami et Beutler, 1988). Le TNF-a serait responsable de la plus grande part des effets endotoxiques, souvent léthaux, observés aux cours d'infections de bactéries Gram négatives: fièvres, diarrhées, hémorragies intestinales, hypotension, oedèmes pulmonaires, dysfonctionnement des reins et coagulation intravasculaire disséminée (Beutler et Cerami, 1986; Tracey et al., 1986). Cette cytokine est la seule capable d'induire un choc irréversible aboutissant à la mort: l'effet léthal du LPS pendant une infection à Escherichia coli est inhibé si les souris sont traitées avec un sérum anti-TNF-a (Beutler et al., 1985b); le même résultat est observé chez des babouins (Tracey et al., 1987). D'autres cytokines comme l'IL-l (Okusawa et al., 1988a) et ITNF-T peuvent accélérer Ie processus en agissant en synergie avec le TNF-a (Cerami, 1992). Introduction 15 Des études récentes montrent que l'hormone, dans la plupart des cas, n'est pas responsable directement des réponses biologiques qu'elle génère, mais qu'elle induit la production de plusieurs cytokines et autres médiateurs qui sont les véritables effecteurs: 1'IL-I, dont les effets sont souvent similaires à ceux du TNF-a; l'IL-6 (ou INF-B2), qui stimule la synthèse des protéines de phase aiguë dans le foie (Hirano et al., 1990); TIL-8, cbimiotacüque pour les neutrophiles (Warren, 1990); la PGEa, responsable de la pyrogénicité du TNF-a et de bien d'autres activités décrites précédemment; et enfin le PAF, induisant la libération d'enzymes lysosomales et de dérivés toxiques de l'oxygène par les neutrophiles, les eosinophiles et les macrophages (Gallin, 1989). Chez des lapins atteints de méningite à méningocoques, l'apparition dans leur liquide cérébrospinal des pics de concentration de TNF-a, d'IL-1 et d'IL-6 est décalée dans le temps, démontrant ainsi !'interconnection existant entre ces cytokines (Waage et al, 1989). Le TNF-a est souvent libéré en réponse à une invasion de microorganismes pathogènes (virus, bactéries, parasites), ou en présence de tumeurs. En ce qui concerne les parasitoses, le TNF-a a surtout été détecté dans les serums de patients atteints de leishmaniose (Leishmania donovani) et de malaria (Scuderi et al., 1986). Cette cytokine est d'ailleurs responsable de la pathologie liée à la malaria humaine, et surtout à sa forme cérébrale, souvent léthalë (Clark, 1967). Kern et al. (1989) montrent, chez des patients infectés par Plasmodium falciparum, que les concentrations sériques de TNF-a et d'IL-6 sont carrelées avec la gravité des dysfonctions organiques. La production de TNF-a serait maximale au moment de Ia rupture des schizontes, ce qui expliquerait aussi les poussées de fièvre observées à cette occasion (Kwiatkowski et al., 1989). Dans les infections à B.burgdorferi, dea titres élevés de TNF-a sont mesurés dans le sérum et Ie liquide synovial de patients séropositifs (Defosse et Johnson, 1992). La concentration de cytokine présente dans des cultures in vitro de macrophages humains ou de cellules peritoneales de souris serait dépendante de la dose de spirochetes ajoutée. Le TNF-a n'a pas toujours un impact négatif sur un animal confronté à une invasion de microorganismes pathogènes. Dans le cas de la leishmaniose cutanée (Leishmania major), des souris traitées avec un anti-TNF-a présentent une exacerbation de l'infection, caractérisée par des lésions plus étendues et une parasitémie plus élevée que chez des souris témoins (Titus et al., 1989). Une injection de TNF-a provoque, par contre, une réduction significative des lésions. In vitro, cette cytokine active les macrophages qui sont alors capables de tuer les parasites (Liew et al., 1990). Le rôle protecteur du TNF-a a été démontré dans des infections à Toxoplasma gondii (Chang et al., 1990), ou Plasmodium chabaudi (Clark et al., 1987; Stevenson et al., 1990). Trypanosoma musculi (Kongshavn et Ghadirian, 1988) et T.cruzi (Black et al., 1989) sont des exemples particuliers: la cytokine est toxique in vitro pour les parasites, mais elle favorise l'infection et l'augmentation de la parasitémie in vivo. Introduction 16 Le TNF-a intervient dans les pathophysiologies associées aux réactions inflammatoires. Il agit sur un grand nombre de cellules inflammatoires et est lui- même sécrété par ce type de cellules. Les macrophages et les monocytes en sont les principaux producteurs, mais les mastocytes (Gordon et Galli, 1990), les kéraunocytes (Küpper, 1990), les cellules de Langerhans (Larrick et al., 1989) et bien d'autres cellules encore (cellules musculaires lisses, cellules de Panetti, etc) peuvent aussi synthétiser du TNF-a. Sa sécrétion est régulée par des cytokines (IL-2, GM-CSF, TNF-a) (Vassalli, 1992), des anaphylatoxines (G5a) (Okusawa et al., 1988b), ou par des dérivés bactériens pu parasitaires. L'étendue de ses activités est très large car pratiquement toutes les cellules, à part les erythrocytes, possèdent un récepteur pour cette cytokine (Cerami, 1992). Source principale de TNF-a, les monocytes/macrophages en sont également la cible majeure. La cytokine permet leur différenciation et leur activation. Ceux-ci répondent par la libération de dérivés toxiques de l'oxygène et de l'azote. Le TNF-a est chimiotactique in vitro pour les monocytes. Il induit chez les cellules endotheliales l'expression in vivo de molécules d'adhésion membranaire (ELAM-I, ICAM-I, et VCAM-I) favorisant l'émigration locale de divers leucocytes, dont les monocytes/macrophages et les neutrophils (Vassalli, 1992). Ces derniers constituent d'ailleurs une autre cible importante du TNF-a, qui agirait principalement sur leur activation et leur motilité. Les études à ce sujet sont nombreuses et présentent des résultats parfois contradictoires, d'après les conditions in vitro ou in vivo des expériences. L'incubation in vitro des neutrophils avec la cytokine résulte en une augmentation de leur migration en réponse à un facteur chimiotactique comme le N-formyl-methionyl-Ieucyl-phenylalanine (FMLP) (Figari et al., 1987). Le TNF-a est aussi directement chimiotactique pour ces cellules comme le montrent Newman et Wilkinson (1989) dans trois différents tests in vitro, confirmant ainsi les observations de Ming et al. (1987). Injectée intradermiquement à des lapins, la cytokine semble provoquer le même effet in vivo (Rampart et al., 1989). Le pouvoir attractant du TNF-a serait aussi indirect, induit par d'autres facteurs libérés en réponse à son activité. Dans la peau, la cytokine stimule chez les kéraunocytes, les fibrocytes, les macrophages et les cellules endotheliales, la production d'IL-8, anciennement nommée "monocyte-derived neutrophil chemotactìc factor" (MDNCF), "neutrophil attractant/activation protein-1" (NAP-I), ou "neutrophil-activating factor" (NAF) (Larsen et al., 1990; Warren, 1990;Facciolie(ai., 1990; Nickoloff et al., 1991). Pour d'autres auteurs par contre, le TNF-a a un effet fortement inhibiteur sur la migration des neutrophiles face à un gradient chimiotactique (Ferrante et al., 1988; Kownatzki et al., 1988). Sa fonction serait d'immobiÜBer les cellules au niveau des sites inflammatoires, empêchant leur recirculation. La cytokine stimulerait plutôt le métabolisme respiratoire, l'adhérence, la dégranulation et le phénomène de phagocytose (Livingston et al., 1989). En plus de promouvoir l'expression des protéines membranaires nécessaires à Ia migration des cellules circulantes en direction des sites inflammatoires, Ie TNF-a a Introduction 17 d'autres effets sur les cellules endotheliales. H peut augmenter in vitro la perméabilité vasculaire endotheliale, ce qui expliquerait les phénomènes d'oedémisation pendant les chocs septiques (Royall et al., 1989). Il bloque l'activité anticoagulante de ces cellules et aurait lui-même une fonction antifibrinolytique. Il induit la libération de facteurs hématopoïétiques nécessaires à la maturation de diverses cellules phagocytaires: GM-CSF, G-CSP (granulocytes) et CSF-I (macrophages). Le TNF-cc stimule la maturation des kératinocytes. fi augmente la prolifération des fibroblastes et leur production de GM- et de G-CSF, d'IL-8, et de PGE3 (Elias et al., 1987). Il inhibe la synthèse de collagène mais favorise celle de collagénase, participant ainsi au remodelage des tissus de soutien lors d'inflammations articulaires. Enfin, cette cytokine a encore un effet stimulateur sur l'activation et la fonction de plusieurs sous-populations de lymphocytes (CD4*, CD8*, B, LAK) (Vassalli, 1992). Ainsi, le rôle central que jouent l'IL-2 dans l'induction de la réponse immunitaire et le TNF-a dans les réactions inflammatoires au niveau de la peau, motive leur utilisation dans notre modèle, dans le but de mieux comprendre les mécanismes qui régissent les relations immunitaires existant entre une tique et son hôte. Introduction 18 1.9. Buts du travail CJe travail a été projeté sur la base des résultats de Girardin (1987) et de Girardin et Brassard (1989; 1990). Les buts recherchés sont les suivants: A. Déterminer l'importance de la charge parasitaire sur le développement de la résistance des lapins contre les tiques, en les soumettant à des infestations successives avec un nombre très élevé, pu très faible d'ectoparasites. Comparer le niveau de résistance acquise chez ces animaux en examinant les perturbations physiologiques occasionnées aux tiques. Caractériser et comparer la réponse humorale et cellulaire des hôtes, à l'aide de tests in vitro comme l'ELISA, les transformations lymphoblastiques (immunité à médiation cellulaire) ou les migrations de neutrophiles (inflammation). Des extraits antigéniques salivaires et tégumentaires sont utilisés afin d'évaluer la production d'anticorps anti-tiques, ou la réponse de lymphocytes spécifiques circulants. B. Moduler la réponse immunitaire des hôtes par des traitements avec des cytokines (IL-2 et TNF-a) présumées jouer un rôle dans le modèle i&pinJI.ricinus, toujours dans le but d'une meilleure compréhension de l'immunité anti-tiques. Tenter de préciser l'importance de ces molécules dans le développement de la résistance. Les résultats obtenus ont permis d'apporter des connaissances nouvelles sur les relations hôte/ectoparasites. Matériel et méthodes 19 2. Matériel et méthodes 2.1. Animaux 2.1.1. Tiques Les tiques utilisées pour les infestations et la préparation des antigènes sont des adultes de l'espèce I.ricinus L. élevées dans notre laboratoire selon la méthode décrite par Graf (1978a). 2.1.2. Lapins Des lapins mâles de la race New Zealand (génotype Chbb) n'ayant jamais été préalablement en contact avec des tiques sont choisis pour ces expériences. Les animaux sont âgés d'environ dix semaines et pèsent entre deux et trois kilos. Hs sont gardés dans l'animalerie de l'Institut et fournis en eau et en nourriture ad libitum. Dans le souci de travailler avec des groupes expérimentaux équivalents, l'emplacement des cages dans l'animalerie est pris en compte lors de leur formation. Le stress dû aux dérangements, le nombre de voisins de cage, l'intensité de lumière, etc, peuvent influencer l'état général et le système immunitaire du lapin. Il nous semble donc important que chaque groupe comprenne des animaux de cages situées à toutes les hauteurs et dans toutes les portions de l'animalerie. 2JZ, Antigènes Un extrait de glandes salivaires, un extrait de tégument enrichi en protéine de 25 kDa et Ia salive de I.ricinus ont été utilisés au cours de ce travail. 2.2.1. Extrait de glandes salivaires (EGS) L'extrait de protéines solubles de glandes salivaires est préparé à partir de tiques femelles partiellement gorgées pendant cinq jours sur lapin, c'est-à-dire au moment où les glandes sont complètement développées (Balashov, 1972). Matériel et méthodes 20 Les tiques sont disséquées à 4°C dans un tampon phosphate salin pH 7.4 (PBS; 1OmM NaH3PO4; 4OmM KjHPO4; 12OmM NaCl) contenant les inhibiteurs de proteases PMSF ImM (phenyl-methyl-sulphonyl fiuorid) et EDTA ImM (ethylene diamine tetraacetìc acid). Les glandes salivaires sont prélevées et placées dans le même tampon à raison de 100 glandes (50 tiques) pour un volume de 5ml. Elles sont homogénéisées sur glace à l'aide d'un broyeur (Polytron, !Cinematica) en position 9 pendant 90 secondes. L'homogénat est centrifugé à 27'000g (rotor SS34, Sorvall) durant 20 minutes à 4°C. Le surnageant est dialyse pendant une nuit à 4°C dans une membrane Spectrapor (6-8*000 cut off) toujours dans le même tampon (2 x 21). Le dialysat est ensuite centrifugé 20 minutes à 43'00Og, puis concentré et diafiltré dans du RPMI 1640 (Gibco), à l'aide d'une cellule Amicon munie d'une membrane d'ultrafiltration Diaflo de PM 10 (Amicon). Le contenu protéique de l'extrait est déterminé par la méthode de Lowry et al. (1951) avec l'albumine sérique bovine (BSA) comme standard. LTSGS est finalement filtré stérile (Acrodiscs 0.2um, Gelman Science) et conservé à -2O0C en aliquota de 0.1ml jusqu'à l'utilisation. 2.2.2. Extrait tégumentaire enrichi en une protéine de 25 kDa (ET) (Rutti et Bros sard, 1939) Après Ie prélèvement des glandes salivaires, le reste des organes internes (intestin, ovaire, muscles, trachées etc.) est enlevé pour ne garder que le tégument qui est homogénéisé et centrifugé comme décrit ci-dessus pour l'EGS. Le surnageant est ensuite traité au sulfate d'ammonium ((NHj)2SO4). La fraction précipitée avec 50-80% de sel est conservée, resuspendue dans du PBS et dialysée une nuit à 40C (2 x 21 PBS) pour enlever l'excès de sel. Le reste de la préparation est identique à celle de l'EGS. 2.2.3. Récolte de salive La méthode de prélèvement de salive a été reprise de Salamin (1988), elle-même inspirée de Tatchell (1967) et de Ribeiro et Spi eIman (1986). Les tiques sont retirées du lapin après cinq à six jours de nutrition et conservées dans des tubes en atmosphère humide jusqu'à leur utilisation. La salivation est déclenchée en badigeonnant le dos des tiques avec 1 à 4ul (selon leur taille) d'une solution de pilocarpine-HCl 5% (p/v) dans du methanol. Après quelques minutes, les tiques sont rincées avec de l'eau distillée pour éviter l'apparition de nécroses sur le tégument, elles sont ensuite fixées sur le dos à l'aide d'une bande adhesive au fond d'une boîte de Petri, et maintenues en atmosphère humide. La salive est recueillie pendant les deux heures qui suivent à l'aide de capillaires de 1OuI dont une extrémité a été adaptée par étdrement à la flamme au diamètre du rostre des tiques. Sitôt récoltée, la salive est immédiatement congelée à -200C en aliquota. Matériel et méthodes 21 2.3. Effets de la charge parasitaire sur l'acquisition de la résistance et la réprnis« immunitaire cellulaire et humorale du lapin 2.3.1. Expérience préliminaire Sept lapins Bont soumis à cinq infestations successives, à des intervalles de vingt-cinq jours. Trois groupes expérimentaux sont définis: un groupe de trois lapins recevant 25 femelles et 25 mâles (Inf-25), un groupe de deux lapins avec 5 femelles et 5 mâles (Inf-5), et un troisième groupe de deux lapins avec 15 femelles et 15 mâles (Inf-15) par infestation. Une prise de sang est effectuée juste avant chaque infestation (jours - 1, 25, 50, 75,100 et 125) pour contrôler la réponse immunitaire humorale des lapins face aux antigènes de tiques. Les procédés d'infestation, d'examen de la biologie des tiques, de prise de sang et de dosage des anticorps par ELISA sont décrits dans les annexes I, IIA et IVA. 2.3.2. Infestations en continu Trois lapins supplémentaires sont infestés par 3 femelles et 3 mâles tous les six jours pendant deux mois (Inf-cont), soit un total de dix infestations. Des prises de sang Bont effectuées aux jours -1, 20, 30, 40, 50 et 60 de l'expérience, pour la recherche d'anticorps anti-tiques. La méthodologie est décrite dans les annexes I, IIA et TVA. i 2.3.3. Modulation de la réponse cellulaire et humorale du lapin par deux degrés d'infestation différents, et conséquences sur le développement de Ia résistance Les groupes expérimentaux Inf-25 et Inf-5, définis dans l'expérience 2.3.1-, comprenant sept lapins chacun, sont soumis à deux infestations successives séparées par un intervalle de vingt-cinq jours. Pour permettre une comparaison directe de la résistance entre ces deux modèles, cinq individus de chaque groupe subissent une troisième infestation avec 15 femelles et 15 mâles. L'examen de la biologie des tiques (annexe I) permet une évaluation de la résistance acquise par les lapins. Des prises de sang (annexe II), plus nombreuses que lors de l'expérience préliminaire, sont faites aux jours -1, 5, 15, 25, 31, 41, 51, 57 et 67; celles des joutb 5, 31 et 51 étant effectuées pendant le repas sanguin des tiques. En plus de l'examen comparatif de la réponse immunitaire humorale (par ELISA, annexe IVA), un aspect de la réponse à médiation cellulaire est examiné par le biais de teste de transformation lymphoblastique (annexe ITIA). Pour ces tests, des concentrations d'EGS et d'ET de lOug/puits, ' ou de concanavaline A (ConA) de O.Sug/puits, sont utilisées. ' 1 Matériel et méthodes 22 2.4. Effets d*un traitement à l'IL-2 recombinante humaine sur l'acquisition de Ia résistance chez des lapins infestés, et sur leur réponse cellulaire et humorale contre les tiques 2.4.1. Antigène Seul l'EGS est utilisé. Pour le test de transformation lymphoblastique, une concentration de 5ug/puits donne des résultats comparables à ceux des expériences précédentes (voir aussi figure 40). 2.4.2. IL-2 L'IL-2 recombinante humaine provient de chez Bachern AG, lyophilisée en ampoules de lOug, contenant chacune 2.23x10* unités. L'activité de la lymphokine a été déterminée par un test sur cellules CTLL (GiIUs et al„ 1978). (N.B. Lors de la seconde expérience, deux ampoules utilisées issues d'un lot différent ne contiennent que 5x10s unités). Les ampoules sont reconstituées juste avant emploi avec du PBS (phosphate de sodium 1OmM, pH 7.4; 15OmM NaCl). 2.4.3. Première expérience Cinq lapins subissent des injections sous-cutanées d'IL-2 (groupe traité à l'IL-2: TIL- 2), dès la fixation des tiques de première infestation. L'IL-2 est administrée toutes les 12 heures, par doses de 4.SxIO3 unités dans 0.8ml de PBS (10 doses au total). Parallèlement, deux groupes de cinq lapins contrôles reçoivent des injections sous- cutanées de 0.8ml de PBS. Les lapins TIL-2 et ceux du groupe contrôle CDir (qui constitue le témoin direct) sont infestés tout d'abord par 5 femelles et 5 mâles, alors que les lapins du groupe contrôle CRés le sont par 25 couples de tiques (ces animaux formant le groupe témoin résistant). Au vingt-sixième jour de l'expérience, les trois groupes de lapins sont infestés une seconde fois par un nombre égal de tiques, 25 couples, pour permettre une comparaison directe du degré de résistance des hôtes. Le traitement avec l'IL-2 n'est pas répété. Des prises de sang sont effectuées aux jours -1, 5,12, 25, 32, 39 et 62 pour la mesure des réponses cellulaire et humorale. Le degré de résistance des animaux est évalué par l'examen de Ia biologie des tiques après gorgement- Leur réponse cellulaire est- estimée par transformation lymphoblastique (annexes I, II et IDA). En plus du dosage des IgG anti-EGS par ELISA (annexe IVA), la mesure de la réponse humorale des hôtes est complétée par une titration des IgM totales dans un test d'immunodiffusion radiale (annexe IVB). Hsruse -Tt met ear thr glu «er nat lia arg aap val glu leu ala glu glu ala lau pro lya lya thr gly gly pro gin Lapin -IO mat aar thr glu aar net He arg aap val glu leu ala glu gly pro leu pro lya lya Bla gly gly pro gin Conaenaua net aar thr glu aar net He arg aap val glu leu ala glu lau pro lya lya gly gly pro gin Hanno -Sl gly aar arg arg cya lau pha leu aar leu pha aar phe leu Ua val ala gly ala thr thr leu phe Cy* tau Lapin -SS gly aer lya arg cya leu cys leu aer leu pha aar phe leu leu vai ala gly ala thr thr leu phe cya leu Consenaua gly aar arg cya leu leu ser leu phe aar phe leu vai ala gly ala thr thr leu phe cya leu Horace -16 leu Ma pho gly vai Ue gly pro gin arg glu glu phe pro arg aap leu «er leu He aer pro leu ala gin Lapin -10 leu hia phe arg val Ue gly pro gin glu glu glu aer pro aan asti leu hla leu val «en pro val ala gin ConoenauB leu hia pha val Ho gly pro gin glu glu pro leu leu pro ala gin Ham» -1 ala — --- *val irg aar aer aar arg thr pro aer aap lya pro val ala hie val val ala a en pro gin ala Lapin -S met val thr leu arg 'aer ala oer arg ala leu aer aap lya pro leu ala hla val val ala aan pro gln val Conaenaua arg aer aer arg aer aap lya pro ala hla val val ala aan pro gin Hanne 33 glu gly gin leu gln trp leu san erg arg ala aan ala leu leu ala aan gly val glu leu arg aap aan gln Lapin 11 glu gly gln leu gln trp leu aer gln arg ala acn ala leu leu ala aan gly net lya leu thr aap aan gln Conaenaua glu gly gln leu gln trp lau arg ala aan ala leu leu ala aan gly leu aap aan gin Komm «¦ leu vai vai pro ver glu gly leu tyr leu ile tyr ève gin vai lau pha lya gly gin gly cya pio aer thr Lapin 4C leu vai vai pro ala aap gly leu tyr leu Ilo tyr aar gin vai leu phe aar gly gln gly cya arg aer tyr Conaenaua leu vai vai pro gly leu tyr leu Ila tyr aer gin vai lau phe gly gin gly cya oer Komme 73 hli vai leu leu thr hll thr ile aar arg ile ala vai aer tyr gin thr lya vai aan leu leu aar ala Ile Lapin 71 -— vai leu leu thr hla thr vai aer arg pha ala vai aar tyr pro aan lya vai aan leu leu aer ala ila Conaenaua 'vai lau leu thr Ma thr oer arg ala v«i aer tyr lya vai aan leu leu «or ala tla Henne 91 lya aar pro cya gin arg glu thr pro glu gly ala glu ala lys pro trp tyr glu pro ila tyr leu gly gly Lapin 9S lyo aar pro cya hlo arg glu thr pro glu glu ala glu pro mot ala tip tyr glu pro ila tyr leu gly gly Consensus lyo aer pro cya arg glu thr pro glu ala glu tip tyr glu pro He tyr lau gly gly Hosoe 113 vai phe gln leu glu lya gly aap arg lau aer ala glu He aan arc pro aap tyr leu Lapin HO voi pho gln leu glu lya gly aap arg leu aer thr glu val aan gin pro glu tyr leu Conaenaua vai pha gln lau glu lya gly aap arg lau aor glu a en pro tyr leu aap pha ala glu aar ¦Bp leu ala glu aer aap ala glu aer Donne 1<> gly gln vai tyr pha gly He ila ala leu 157 Lapin ItS gly gln val tyr phe gly He ile ala leu 15* Conaenaua gly gin vai tyr pha gly Ha Ha ala leu HOnOlOgIa1 78.«» Tableau 1: Séquence protéique du TNF-a humain et du TNF-cc de lapin (d'après Pennica et a/.,1984; Ito et ai, 1986) Matériel et méthodes 23 2.4.4. Expérience complémentaire Un lot de treize lapins est réparti dans les groupes expérimentaux préalablement décrits: cinq lapins dans TIL-2, cinq dans CDir et trois dans CRés. Les animaux sont infestés selon le protocole décrit plus haut (2.4.3.). Les lapins traités reçoivent des doses plus faibles de lymphokine (3.8x10s unités). En effet, deux ampoules d*IL-2, provenant d'un lot dont l'activité est cinq fois inférieure à celle du lot précédent, ont dû être utilisées (voir 2.4.2). Au vingt-sixième jour de l'expérience, les lapins subissent un test cutané d'hypersensibilité aux antigènes de tiques (annexe IIIC). Les autres paramètres mesurés sont les mêmes que précédemment. 2.5. Effets du TNF-q sur l'acquisition de la résistance et sur la réponse immunitaire des lapins infestés 2.5.1. Antigène Seul l'EGS est utilisé dans les tests mesurant la réponse immunitaire des hôtes. 2.5.2. TNF-a La cytokine est du TNF-a recombinant humain (tableau 1), fourni en ampoules de 2ml (Genentech), contenant chacunes 0.49mg de protéine/ml (activité spécifique: 5xlOT unités/mg). L'activité spécifique de l'hormone a été déterminée dans un test de cytotoxicité sur des cellules L-M (d'après Williamson et al., 1983). Les ampoules sont conservées à 40C, et diluées juste avant emploi dans du PBS (phosphate de sodium 1OmM, pH 7.4; 14OmM NaCl), ou du PBS complété de 0.1% de gélatine. 2.5.3. Vaccination contre le TNF-a Quatre lapins subissent chacun une injection intradermique de 10° unités de TNF-a, diluées dans 25OuI de PBS, le tout emulsionile dans 250ul d'adjuvant complet de Freund (ACF, Difco). Trois lapins témoins ne reçoivent que le tampon et l'ACF. Trois rappels sont pratiqués à quinze jours d'intervalle avec les mêmes doses de TNF- a/PBS (ou de PBS seul) mélangées à de l'adjuvant incomplet de Freund (AIF1 Difco). Les titres d'anticorps anti-TNF-a sont contrôlés par ELISA (annexe IVA) sept jours après chaque rappel. Une semaine après le troisième rappel, les lapins sont infestés par 25 femelles et 25 mâles. Un nouveau rappel est effectué vingt jours plus tard, une semaine avant une seconde infestation avec 25 couples de tiques. L'acquisition de la résistance chez les lapins vaccinés et chez les témoins est évaluée Matériel et méthodes 24 par l'examen de la biologie des tiques (annexe I). La réponse cellulaire est testée par transformation lymphoblastique (annexe mA) lors des prises de sang faites après le rappel 3 et les infestations 1 et 2. Un dosage des anticorps anti-EGS (ELISA, annexe IVA) et du C3 sérique (immunodiffusion radiale, annexe XVB) complète l'étude. 2.5.4. Traitement des lapins au TNF-a Cinq lapins sont traités avec du TNF-a aux jours -2, 0, 2, 4 et 6 d'une première infestation avec 20 couples de tiques. Les doses intraveineuses pour chaque animal sont déterminées d'après Otsuka et al. (1990). La cytokine, 3xlOG unitésAnjections, est diluée dans 200ul de PBS-gélatine 0.1%. Deux lapins supplémentaires servent de témoins, et ne reçoivent que le tampon de dilution. Au vingt-sixième jour, chaque animal (traité ou témoin) subit une seconde infestation avec 13 couples de tiques. Les injections intraveineuses de TNF-a sont répétées pendant le repas sanguin, c'est-à- dire aux jours 26, 28, 30, 34 et 36 avec des doses plus élevées: 3x10s unités/kg pour chaque lapin (2.5 kg). L'acquisition de la résistance par les lapins traités et les témoins est évaluée comme précédemment. Des prises de sang sont pratiquées aux jours -2 (avant l'injection de la cytokine), 5,12, 25 et 31 de l'expérience. Un dosage des anticorps anti-tiques (IgG et IgM) et du C3 sérique est effectué. L'effet potentiel du traitement au TNF-a sur la prolifération des lymphocytes (transformation lymphoblastique) et la migration des neutrophils (test décrit dans l'annexe UlB) est aussi vérifié. 2.6. Effets in vitro des antigènes__de tiques aur les lymphocytes et les neutrophiles de lapins indemnes ou sensibilisés par les tiques 2.6.1. Effet sur les lymphocytes Des lymphocytes de lapins sont isolés et cultivés en présence d'antigènes de tiques dans un test de transformation lymphoblastique (annexes UB et UIA). Dix lapins indemnes et six sensibilisés sont testés. Ces derniers comprennent des animaux ayant eu un contact avec les ectoparasites: soit une infestation massive (environ 40 femelles, 2 lapins), soit au moins deux infestations de 15 paires de tiqueB adultes (4 individus). L'effet des antigènes de tiques sur les lymphocytes est mesuré avec des concentrations croissantes d'EGS, d'ET et de salive: O.Ol, 0.1» 0.5, 1, 2, 4, 10» 20ug/puits pour l'EGS et 1*ET et 0.02, 0.1, 0.5, lui/puits pour la salive. Les antigènes sont utilisés avec ou sans l'addition de conA (0.5ug/puits). Les résultats obtenus pour les lapins indemnes ou sensibilisés sont finalement comparés. Matériel et méthodes 25 2.6.2. Effet sur les neutrophiles Le pouvoir chimiotactique ou inhibiteur de différentes concentrations d'antigènes de tiques (EGS, ET et salive) est mesuré dans un test de migration des neutrophiles (Falk et al. 1980). L'isolation des neutrophiles et le test de migration sont décrits dans les annexes HB et IJIB. Des neutrophiles de cinq lapins indemnes et de quatre sensibilisés (voir chap. 2.6.1.), sont utilisés pour ces tests. Des concentrations croissantes d'EGS (0.01,0.05,0.1,0.2, 1, 2 et Gug/puits), d'ET (0.01, 0.1, 0.5, 2, 5 et lOug/puits) ou de salive (0.2 et lui/puits) sont incubées soit dans le compartiment inférieur de la chambre de migration, soit directement avec les cellules. 2.7. Effets du sérum de lapins sensibilisés aux tiques sur la prolifération de lymphocytes de lapins indemnes ou sensibilisés La préparation du sérum, l'isolation des lymphocytes et le test de transformation lymphoblastique sont décrits dans les annexes II et IDA. Les sérums proviennent des expériences "charge parasitaire" et "IL-2" (voir sous 2.3. et 2.4.1.). Une concentration optimale de 20% dans du RPMI complet sans FCS (tableau B, annexes) est utilisée. Elle a été établie lors de tests préliminaires. Les cultures sont réalisées avec ou sans l'addition de conA (O.Sug/puits), avec les cellules d'un lapin indemne, ou en présence de 5ug/puits d'EGS, avec les lymphocytes d'un lapin sensibilisé (voir chap.2.6.1.). Des cultures avec 20% de FCS servent de témoin. Les sérums de l'expérience "IL-2" (préalablement conservés à -800C) sont testés directement, ou après avoir subi une incubation de 30 minutes à 56°C, ce qui inactive le système complément. 2.8. Statistique Les données de la biologie des tiques sont traitées par le test non paramétrique de Mann-Whitney (Siegel 1956, analyse globale), le test exact de Fischer (proportions) et le test G (Likehood ratio chi-square; histogrammes de fréquence). L'analyse de variance (General Linear Model, SAS Institute Inc., 1989) et le test t de Student sont utilisés dans l'étude de la réponse immunitaire (cellulaire et humorale) des lapins. Ces tests exigeant une distribution normale des valeurs, une transformation log10 des cpm nets et des titres d'anticorps est effectuée avant l'analyse. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 26 3. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 3.1 Effetffjde la charge parasitaire sur l'acquisition de la résistance et la réponse immunitaire cellulaire et humorale du lapin 3.1.1. Expérience préliminaire 3.1.1.1. Remarques générales Noua avons cherché à définir deux modèles expérimentaux bien différenciés quant à leur comportement immunitaire face aux tiques: un modèle avec des hôtes fortement résistants; et à l'opposé, un modèle où les animaux ne parviennent pas à développer de résistance. Si l'on se réfère à la littérature, un modèle résistant est aisé à obtenir avec des lapins. L'autre modèle pose plus de problèmes. Il implique deux variantes: soit le système immunitaire de l'hôte n'est pas suffisamment stimulé pour générer une réponse, soit il est affaibli et épuisé par un contact répété avec de très fortes doses d'antigènes (tolérance à haute dose). Deux stratégies sont ainsi retenues: a) Moduler la réponse de l'hôte en faisant varier la charge parasitaire. Un petit nombre de tiques serait insuffisant pour stimuler un lapin, alors qu'une infestation massive provoquerait une forte réponse immune. b) Epuiser le système immunitaire de l'hôte par des infestations massives et répétées. Dans cette optique, deux groupes de lapins comprenant respectivement trois et deux individus, sont infestés avec 25 ou 5 couples d'adultes, ceci à cinq reprises au cours de l'expérience. Un troisième groupe de deux lapins, infesté avec 15 paires de tiques, sert de témoin comparatif. H correspond aux protocoles généralement utilisés dans le modèle lapin//, ricinus. 3.1.1.2. Biologie des tiques Les résultats sont présentés dans le tableau 2 (page suivante) pour les trois groupes. s Zfr) (28 fri) Tf Ö Ve' ±1.4 ±51.6 66.7% 5.7% ±6.3 ±6.3 ±0.06 Q Z « CN CO o Tf O co S Oi TH CO 0.1 SS 47) 18) S 18) 18) Tf i S § g w 3 © jg 6.8 ± 58.6 ± •-< OO co 11.1± 24.7 ± 0.21 ± P^ I (64) (20) III (17) 1.7 52.5 se se tJ CO 2.2 15.9 0.10 g ti Ol ti CN 78. >-i eo ti ti CO ti CC id CO ed 3 GÌ oi —i 0.1 S es Tf oi Oi oi oi ä ifi F] H H H H S ¦H +" « otj W U3 0 cd in d cd *i Ol HNO §§$§§§§§ CO C0 TfcOtJjeN»O00 öS SSSSsS m >Ç aC Tf ci "~t -SS-p-o « p a" -M 41 tl io »o io Tf eo -t. TH- O Tf" C* Tf h id-; S§2 Tf Tf Tf Tf CO CO «8 O tH tl tl i> IO d P^ CO CO IO ggSp-O d d * * « Tf Tf CO CO CO « (M* P* H(DO ¦a s , tw v ! J S > 3.|g TlI -3 ! ïoS ! aal Ls » s. is s.* !S g g i -a -a g 1 o Jr i» ' o, Z &. O C 11IJ •o « - - !si! 3 i (14) 3 3 3 3 1.7 24.6 Ä se -T O o s Ol p- — P- S CO O CO S i3i39§§§§3 0.9 P-CO se se 0.0 5.7 0.0 se tt tl ti ti ti S CO O Ot TH O O ** CO t? O I-l O) 0.1 53ëëë§gg S â-a ««33 z£ Ni H CL. CS b. 9 S RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 27 3.1.1.2.1. Groupe ïnf-25 Dès la seconde infestation, le poids de gorgement, ainsi que le poids, le rendement et la fréquence de ponte, diminuent fortement (p<0.001 par rapport à la première infestation). Dans un même temps, le pourcentage de tiques pesant moins de lOOmg augmente significativement (p<0.001). Lors des deux infestations suivantes, l'effet de la résistance s'accentue encore légèrement, mais plus de manière significative si l'on compare ces résultats avec ceux de la seconde infestation. En cinquième infestation, seuls le poids et le rendement de ponte diminuent encore. Les tiques sont plus nombreuses à pondre, et leur poids de gorgement est significativement plus élevé par rapport à celui des infestations 3 et 4 (p<0.05). L'embryogenèse semble peu perturbée par le développement de la résistance: la fréquence d'éclosion des pontes n'est diminuée significativement qu'en seconde infestation (p<0.01). Un allongement progressif du temps de gorgement est observé. Le repas sanguin de cinquième infestation est plus long que tous les autres (p<0.001). Le temps de préoviposition est plus variable, mais suit la même tendance. 3.1.1.2.2. Groupe Inf-5 En raison du peu de tiques récoltées au cours des cinq infestations et de la variabilité des résultats (voir écarts-types), aucune modification statistique des paramètres de leur biologie n'est mise en évidence. Cependant, une diminution progressive du poids de gorgement et du poids des pontes, toutefois moins prononcée que dans le groupe Inf-25, est observée jusqu'en quatrième infestation. A la cinquième, ces deux paramètres augmentent à nouveau légèrement. Le rendement et la fréquence de ponte, de même que les temps de gorgement et de préoviposition subissent des variations irrégulières au cours des infestations, sans véritable tendance générale. 3.1.1.2.3. Groupe Inf-lS Il faut attendre la quatrième infestation pour observer une diminution significative du poids des tiques gorgées, accompagné d'une augmentation du nombre d'ectoparasites de moins de lOOmg (p<0.01 par rapport aux infestations 1, 2 et 3). Le poids et le rendement de ponte régressent également, mais pas de manière significative. Un des deux lapins étant mort après la seconde infestation, le nombre de tiques récoltées n'est plus suffisant pour analyser statistiquement les résultats. La fréquence de ponte, tout d'abord anormalement basse, remonte en seconde infestation, puis diminue significativement jusqu'à la fin de l'expérience (p<0.05). Comme dans le groupe Inf-5, les temps de gorgement et de préoviposition subissent des variations sans qu'il soit possible d'établir une véritable tendance. N.B. Pour les groupes Inf-5 et Inf-15, la fréquence d'éclosion des pontes de quatrième infestation n'est pas considérée dans l'examen des effets de la résistance sur la biologie des tiques, vu le très petit nombre d'ectoparasites concernés (un par groupe). Poids des tiques gorgées 2 3 4 5 infestation lnl-25 ? lnf-5 Ul InMS Poids des pontes 2 3 4 5 Infestation lnf-25 ? lnf-5 [Ü3 lnf-15 c) Rendement de ponte 2 3 lnf-25 ? lnf-5 lnf-15 Infestation Figure 3: Expérience préliminaire. Comparaison entre les groupes expérimentaux de différents paramètres de la biologie des tiques (moyennes ± éc.-t.) * fxO.05 entre lnf-25 et lnf-5 * p<0.05 entre lnf-25 et lnf-15 t [XO.05 entre Inf-6 et InMS RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 28 3.1.1.2.4. Comparaison de résistance entre les trois groupes expérimentaux Trois paramètres de la biologie des tiques, qui reflètent particulièrement le degré de resistance acquise par les hôtes, vont servir à la comparaison des groupes Inf-25, Inf-5 et Inf-15: le poids des tiques gorgées (figure 3a), le poids des pontes (figure 3b) et le rendement de ponte (figure 3c). La résistance chez les lapins Inf-25 se manifeste, au niveau des paramètres examinés, dès la seconde infestation déjà. L'acquisition d'une protection contre les tiques semble donc beaucoup pluB rapide dans ce groupe que chez les lapins Inf-15, puisqu'il faut attendre la quatrième infestation pour observer une diminution significative de ces paramètres. Quant au groupe Inf-5, les perturbations de Ia biologie des tiques restent faibles, même après cinq infestations. Si l'on compare les traitements de manière globale par analyse de variance, les résultats obtenus pour le groupe Inf-25 sont significaüvement différents du groupe Inf-5 pour les trois paramètres considérés (p<0.05). Les groupes Inf-25 et Inf-15 diffèrent également au niveau de l'évolution du poids et du rendement de ponte (p<0.001), alors que les groupes Inf-15 et Inf-5 ne sont pas statistiquement différents. En fait, le groupe Inf-15 semble développer un degré de résistance intermédiaire par rapport à ceux des groupes Inf-25 et Inf-5. 3.1.1.3. Sérologie Au cours de l'expérience, la production d'anticorps IgG contre l'EGS (figure 4a, page suivante) augmente progressivement dans les trois groupes expérimentaux. Les titres sont en général plus élevés chez les lapins Inf-25 et Inf-15 que dans le groupe Inf-5. Cependant, en raison du petit nombre d'animaux utilisés et d'une réponse plutôt hétérogène au sein d'un même groupe (figure 4b), toute conclusion reste prématurée. La tendance semble toutefois être confirmée par les titres d'anticorps IgG contre 1*ET qui sont également les plus élevés (en moyenne) dans le groupe Inf-25 (figure 5a, page suivante). Pris individuellement (figure 5b), les lapins Inf-25 sont les animaux répondant le mieux contre cet extrait antigénique. La charge parasitaire pourrait donc influencer la production d'anticorps contre les tiques. 3.1.2. Infestations en continu 3.1.2.1. Remarques générales En complément à l'expérience préliminaire, un autre modèle expérimental est testé, associant l'effet d'infestations nombreuses et rapprochées (tous les six jours) avec celui d'une très faible charge parasitaire (trois couples d'adultes par infestation). Ce modèle assure une présence continue des tiques sur leurs hôtes pendant une durée de deux mois. H permet de vérifier si le rapprochement et l'augmentation du nombre des infestations peut compenser la dose très faible d'antigènes injectés, et induire chez l'hôte le développement d'une résistance. t- M O) ^- U) (D Is- £ S e .e e e e "O. Q. Q. O. Q. 9- 9- cd en ro W ro co a S 0 esta i n C « a U) i i ¦f C m O § - .g. co e- i s «-5 anti enne tta ta CM Tl >. P ai bï T- S"22 W C tèmo ä fa < 5 fsss" ,'¦fKSSSW-v f \;.< l-:*?£äS!^!*» -«-^^Sssî;«!.-ss8 #iss\. ¦ >"*!'"" '--5*¾* ljS¥«S.K'.-BäSSS«3"Ji' U) U) m m -¦É 'S 1E ÌDÉ ï t- cm « * io ids utrt I dui; )ids -équ ,S e- cu Z &. H cu òs &. 8ème infestation sssssêss 0.6 49.7 1% 4% 1.5 14.9 0.07 0% OtO)IOC-IOOlOT c> O) O) O) N. CO CN O 7ème infestation 83SPPPPtS 4 ±2.1 8 ± 40.4 37.5% 87.5% 1±1.8 0 ± 15.9 3 ± 0.10 71.4% -§ -83 O ssssssss stati . » _ .. « ì.i IO C- £& 1.9 9.5 0.1 S -H CO O co co co « CO C- Ö O QO to 136 O CO S «5 T~ eì OÎ o> O? <-< il co (N O) CO <°" se »s • ^ "! se H'f!»f:NoS * «ori « « «ò cococoïoooc-io co M IO C- 'l CO W-HO •a E 8 il III IH *&¦; o) d « s'H O 3 & O, 2 Ck &5 1 f O CQ ¦h M aal*; II B Qj ¦S =i j-9 Sd RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 30 mg 300i 200- 100- & 1 8 Infestations Figure 6: Infestations en continu. Moyennes ± éc.-t. du poids des tiques gorgées. n: nombre de tiques %120 90 60 a) 30- -^- lapin 9 -&r lapin 10 lapin 11 médiane 60 Jours 60 Jours Figure 7: Titres d'anticorps IgG mesurés par ELISA a) anticorps anti-EGS b) anticorps anti-ET 33IIIIIS .-ô to m *t tri od +• +l w 3 « w ai *» o u "O co c* sg£3sd£ S « CO « 0I ** •* o eaooucaou. *-t i-< r-l. » co O O ?) « O 5¾ 3* CO ¦* 3.7 61.2 0.13 g 11.0 ± 93.2 ± 0.37 ± id E- 'S E a? S s1 a o er M 'S OJ m ¦a ai m -a ta tïï£ ii ' ! >2l a kl 3 Tî CO >* a. "S a g S« i s a, 3 k. (D a 8. M Ol 111 8 S.! a c * 01 O) U ¦a P co » « 3 I1Sl OVk, ft. Qi b tS C O m 3 S g I 'S. a % E (U 3 .5* S US .h a ii o B '£ S g Cl .** *s, «H a g ¦a V O) E 3 Si 2* "-3 US P C 11 O B 3 *-' 3 B OI 'S. « 0) ki 3 ¦« .? •-I U) U) •é 1-1 Illllill ! siggsSsis ¦e infes atre lèi ilillSSI u O (O 00 ¦* e- » N 3 IL- 3 t- U3 C O ¦3 3 M nfe -— 2 ¦« T-I S g ï* Sî?î IN ^ 92 S r-l fH « 1.3 119. 3? ae CO CD 52.1 M H N M +» O « C*î C- « l> 9 £3 S. Si Ö 99SPPP9 N ci —I1 tH .H tH j-I *i CD lo S 3? 35 g « », »-I O ^ V C- IO C- CO CO -J 88333 IO ¦H çq S* Sg U, C. « ¦ O s* rf W *» H çç Q +» ce n « S) io CO Cl l> CO US -a E S A ï e ^ S £ O 5 Tl Sl If fil S J 1.1 Is &J •a 3 ^ -a S"- a « « «1 O a 4 a c s «I s S O (V t. b o. a: b iîiiiili Î=ïee33e g « « S ci « ti oi a Ol ¦a -a SS5S-5 T-] V* O « C- »-I „ IO IO (M CO •2 1 * >o o o CO (N S3 ö (O OO rt Tl « I S CO 'S *? f UI) 1 ! n a- ^- Si 4 3« "3 -s ï D) El 1 e ponte 11 I8" "3 4¾ ! •a S. •a ä 3 ai -3 m g § B) ids de 1 1 ids de ndem 1 O U O (U L, a. "Z, Ch Ch cd Ul v -9 3 E fil RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 38 biologiquement active in vivo chez le lapin, ce qui semble d'ailleurs être le cas pour tous les modèles couramment utilisés en médecine humaine et vétérinaire. Les groupes de lapins de cette expérience sont définis à partir des résultats précédents. Les animaux faiblement infestés sont traités avec la lymphokine pendant la première infestation, afin de provoquer une stimulation accrue de leur système immunitaire pendant la phase d'induction de Ia réponse, et pour qu'ils expriment très rapidement un degré élevé de résistance. Selon le chapitre 3.1., le groupe de lapins infestés par vingt-cinq tiques constitue le témoin hautement résistant. 3.2.2 Première expérience 3.2.2.1. Effet du traitement à lTL-2 sur Ia biologie des tiques Dès la première infestation, les tiques nourries sur les lapins traités TIL-2 présentent des perturbations de leur biologie (tableau 5). Leurs poids de gorgement sont nettement inférieurs à ceux observés dans le groupe témoin direct CDir et le groupe témoin résistant CRés, bien que le temps de gorgement soit identique dans les trois groupes- Près de 68% de ces tiques pèsent moins de 100mg, ce qui est significativement différent des 33% du groupe CRés (voir le tableau pour les valeurs de p). Dans un histogramme de fréquences du poids des tiques gorgées (figure 13, page suivante), la distribution des tiques du groupe TIL-2 est nettement en faveur des faibles poids, en comparaison des groupes contrôles. Le traitement à l'IL-2 semble aussi avoir un effet sur l'ovogenèse. La fréquence, le poids et le rendement des pontes sont bien inférieurs dans le groupe TIL-2 à ceux mesurés dans les groupes contrôles. A la seconde infestation (tableau 5), tous les groupes de lapins montrent des signes de résistance contre les tiques: temps de gorgement plus long, poids d'engorgement plus faible. Dans le groupe CRés, la fréquence, le poids et le rendement des pontes sont aussi significativement diminués. Mais c'est dans le groupe TIL-2 que la résistance perturbe le plus la biologie des ectoparasites. L'histogramme de fréquences de leur poids de gorgement (figure 13) diffère significativement pour ce groupe de celui des groupes contrôles (p<0.05 au moins). Plus de 80% des tiques récoltées pèsent moins de lOOmg, et seul un tiers d'entre elles parviennent encore à pondre. Ces valeurs sont significativement inférieures à celles mesurées dans le groupe témoin direct CDir. H en est de même pour le poids et le rendement de ponte. 3.2.2.2. Sérologie 3.2.2.2.1. IgM totales Les résultats obtenus par immunodiffusion radiale ne mettent en évidence aucune modification des titres d'IgM totales dans les plasmas des lapins TIL-2 (figure 14, page suivante). De légères augmentations de la concentration d'IgM, par rapport aux valeurs mesurées avant le début de l'expérience, sont observées au jour — -fZZ ^jKBSi -L - -WtìW -----E *"H -F^ ? ¦m -L ffi! QQl H___ j S^ S3 SSS £ «e S a ® ~ O CC J UUF [ DlI d I ^jH a f ! fJÜ I C ^ f^sss i ^^^^^^^^M ^-.W-^-K-.KK. C ----------- v E i B ~ S Œ -J Ü U F QII [ I cJ i ci Seco tu 1— '.;-¾'':"-;¾;*¾¾¾:; I...... S: ff I! n P .a-g (%) seouenbaij S S Ï {%) raauenbey RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 39 12 dans le groupe CRés, et au jour 39 dans le groupe CDir, mais elles restent non statistiques par rapport aux valeurs mesurées avant le début de l'expérience. Aucune différence n'est constatée entre les groupes. 3.2.2.2.2. Réponse humorale à l'EGS Une production significative d'anticorps IgG anti-EGS est observée dans les groupes CDir et CRés dès le jour 12 de l'expérience (p<0.05; figure 15). La deuxième infestation provoque un accroissement plus rapide des titres, qui sont maximaux au jour 39. Chez les lapins TIL-2, la réponse est plus tardive. Les titres n'augmentent significativement qu'à partir de la seconde infestation (jour 32; p<0.001 par rapport au jour -1). Fis restent inférieurs à ceux mesurés dans le groupe CRés (p<0.05) durant toute l'expérience. La production d'anticorps est également plus faible que dans le groupe CDir, à l'exception du jour 32. 3.2.2.3. Transformation lymphoblastique 3.2.2.3.1. Réponse à l'EGS (figure 16, page suivante) Comme précédemment, les lymphocytes des lapins des trois groupes prolifèrent in vitro au contact de l'EGS dès la première infestation (jour 5; p<:0.05 pour TIL-2, p<0.01 pour CDir et CRés). La réponse lymphocytaire diminue après le détachement des tiques, pour n'être plus différente, au jour 12 pour le groupe TIL-2 et 25 pour les groupes contrôles, des mesures prises avant le début de l'expérience (jour -1). Pendant la seconde infestation, la prolifération est à nouveau significative dans les trois groupes, avec des valeurs plus élevées qu'en première infestation (jour 32; p<0.001). Elle retourne aux valeurs initiales dans les groupes TIL-2 et CRés dès la fin du repas des tiques. L'analyse statistique ne met en évidence aucune différence entre les lapins traités à l'IL-2 et les animaux contrôles. Cependant, les résultats obtenus pour le groupe TIL-2 avec l'EGS sont en moyenne toujours plus bas que ceux du groupe témoin direct CDir. 3.2.2.3.2. Réponse à la conA La réponse des lapins TIL-2 à ce mitogene (figure 17, page suivante) est significativement plus élevée que celle des autres groupes (p<0.01). Cependant, cet écart existe déjà avant le début de l'expérience et ne peut être attribué aux effets du traitement. Il convient ici de rappeler, en raison de ces résultats équivoques, que les animaux ont été répartis dans les groupes au hasard. Comme nous l'avions observé dans l'expérience sur les effets de Ia charge parasitaire, la prolifération lymphocytaire baisse temporairement dans les trois groupes pendant la durée des infestations. 39 Jour Figure 16: Transformation lymphoblastique. Réponse à l'EGS. Moyennes ± SE. Figure 17: Transformation lymphoblastique. Réponse à la conA. Moyennes ± SE. Jour RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 40 3.2.3. Considérations intermédiaires Cette expérience met en évidence un effet certain du traitement à l'IL-2 des lapins sur la biologie des tiques. Mais elle donne peu d'indices permettant de comprendre comment la lymphokine agit sur le système immunitaire du lapin pour aboutir à l'augmentation de résistance observée. LHKT est en général un bon reflet de la réponse immunitaire à médiation cellulaire (Meltzer et Nacy, 1989). Des lapins infestés plusieurs fois par 10 couples de I.ricinus développent d'intenses réactions dlîRT (Girardin et Brossard, 1985), qui sont atténuées si l'on injecte aux hôtes de la cyclosporine A (Girardin et Brossard, 1989). Parallèlement, les effets de la résistance sur la biologie des tiques sont fortement diminués chez les lapins traités avec cette molécule (Girardin et Brossard, 1990). La cyclosporine A, qui est un immunosuppresseur, inhibe !'activation des lymphocytes T helper (Schreiber et Crabtree, 1992), notamment en bloquant la synthèse d'IL-2 (Thomson et al., 1986). D'autre part, l'IL-2 est capable d'augmenter I1HRT au dinitrochlorobenzène (DNCB) chez des souris sensibilisées à cet allergène de contact (Zaloom et al., 1991). Ainsi, l'expérience a été répétée, en incluant dans le protocole expérimental un test cutané pour mesurer I1HRT des lapins aux antigènes de tiques. 3^.4. Expérience complémentaire 3J2.4.1. Remarque préliminaire Le groupe CRés ne comprend que trois lapins, car nous connaissons déjà bien ce modèle expérimental. Le nombre de tiques récoltées reste suffisant pour les analyses statistiques. Dans cette expérience, l'attention est plutôt focalisée sur la comparaison du groupe TIL-2 avec son contrôle direct CDir. &2.4.2. Réponse cellulaire des lapins 3.2.4.2.1. Test cutané Les lapins subissent le test au jour 26, c'est-à-dire au moment correspondant au début de la seconde infestation de l'expérience décrite plus haut (3.2.2.). La zone de peau témoin, Bite d'injection du tampon de dilution de l'antigène (RPMI 1640), réagit de manière équivalente dans les trois groupes (figure 18, page 41). Seul un léger épaississement est mesuré à 6h; celui-ci disparaît ensuite complètement. Les résultats du test concernant la réponse à PEGS sont présentés à l'état brut, sans avoir soustrait les valeurs de la zone de peau témoin, puisque celle-ci n'évolue pas et réagit de la même manière dans les trois groupes (figure 19, page 41). Les lapins CDir développent, dans la première heure, une réaction cutanée passagère mais significative à l'EGS (p<0.05 à 50 minutes). La peau commmence à s'épaissir RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 41 lapin Epaississe ment de la peau au site d'injectio i (mm xlO* io- 20' 30' 40* 50' 60' 6h 24h 48h 72h 96h TIL-2 1 60 56 41 51 64 55 202 431 •441 *325 *311 2 12 15 31 40 8 38 74 288 »347 »283 •272 3 45 45 59 58 85 97 202 298 •295 130 56 4 36 46 35 30 25 14 36 102 72 51 40 5 15 10 41 55 63 50 63 71 71 48 34 CDir 6 33 49 52 64 64 84 175 233 "163 86 60 7 31 21 35 41 94 81 81 176 205 113 75 8 12 14 11 20 50 30 75 170 *179 '137 122 9 35 83 88 113 101 78 126 178 73 33 28 10 14 46 39 54 70 70 48 155 127 101 69 CRéa II 49 43 63 50 60 50 100 210 •174 •148 153 12 36 35 45 42 32 42 69 81 92 93 90 13 10 14 23 19 16 28 59 64 94 38 22 •: indurations Tableau 6: Test cutané. Réaction à I1EGS. Mesures individuelles 40On 300- M :200 ? CDIr [B CRés ¦ TIL-2 100- 10 2a 301 40' SO- 60* 6h 24h *8h 72h 96h Temps Figure 18: Test cutané. Réaction au tampon de dilution de l'antigène (RPMI 1640). Moyennes ± SE. 400 10" 20* 3O 40* 50" 60' 6h 24h 48h 72h 96h Temps Figure 19: Test cutané. Réaction à l'EGS. Moyennes ± SE. 1ère infestation TIL-2 (n=5) 5 Uques/lapin CDir (n=5) 5 tiques/Iapin CRés (n=3) 25 tiques/lapin Poids des tiques gorgées (mg) Nutrition perturbée (tiques <10Û mg) Fréquence de ponte (%) Poids des pontes (mg) Rendement de ponte 165.5 ±96.9 (26) 178.7 ±89.6 (20) 165.7 ±80.1 (74) 30.8% (8) 20.0% (4) 24.3% (18) 80.8% (21) 85,0% (17) 87.8% (66) 64.3 ±43.3 (21) 75.9*36.0 (17) 64.7 ±40.3 (65) 0.25 ±0.17 (21) 0.36 ±0.16 (17) 0.29 ±0.18 (65) Légende, voir tableau 5 Tableau 7: Biologie des tiques. Expérience complémentaire. 140 120 100 80 60- 40- 20- 0 a CDIr m cRés H TIL-2 Jî I S Hl 12 25 Jour Figure 20: Transformation lymphoblastique. Réponse à l'EGS. Moyennes ± SE. ": p<0 "1 entre CDIr et TIL-2 #: jkO.05 entre CDir et CRés Jour Figure 21: Transformation lymphoblastique. Réponse à la conA. Moyennes ± SE. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 42 dans les trois groupes après Gh. Un maximum est atteint après 24h dans les groupes CDir et CRés (p<0.001 et p<0.01 respectivement), et après 48h dans le groupe TIL-2 (p<0.001). Les réponses mesurées dans les trois groupes ne sont pas significativeroent différentes, probablement en raison de l'importance des variations individuelles. Un examen des mesures effectuées pour chaque lapin (tableau 6, page 41) montre que trois individus TIL-2 (n°l-3) développent des réactions cutanées spectaculaires, accompagnées de fortes indurations, à 24h, 48h et 72h. Des indurations sont également constatées chez les lapins 6, 8 (CDir) et 11 (CRés), mais les épaisBÎssements de peau ne sont pas aussi importants que chez les lapins TIL-2. Par contre, les individus 4 et 5 (TIL-2) ne présentent pas de réponse nette à l'EGS. 3.2.4.2.2. Transformation lymphoblastique Comme nous l'avions vu précédemment, une réponse significative des lymphocytes en présence d'EGS (figure 20) est mesurée dans les trois groupes dès le jour 5 (p<0.01). Contrairement à notre première expérience (chap. 3.2.2.), la prolifération lymphocytaire augmente progressivement après le détachement des tiques jusqu'au jour 25, date de notre dernière prise de sang. Une comparaison des groupes montre que la réponse des lapins TIL-2 à l'EGS est toujours significativement plus basse que celle des lapins CDir (p<0.01). Dès le jour 12, la réponse du groupe TIL-2 est également inférieure à celle du groupe CRés. La prolifération en présence de conA la plus élevée est observée dans le groupe CDir (figure 21). L'écart avec les deux autres groupes est significatif (p<0.05), mais semble indépendant de l'expérience effectuée. En effet, cette différence de réponse existe déjà au jour -1, c'est-à-dire avant toute expérimentation des lapins. Plus intéressante est la diminution de prolifération lymphocytaire à nouveau présente dans les trois groupes de lapins pendant la durée du repas sanguin des tiques. Cette baisse est significative (p<0.05 au moins). &2.4.S. Biologie des tiques Seuls les paramètres suscitant un commentaire sont présentés dans Ie tableau 7. La moyenne du poids des tiques récoltées sur les lapins CRés semble anormalement basse par rapport à tous nos résultats précédents. Jusqu'à présent en première infestation, les ectoparasites s'étaient toujours mieux nourris sur des lapins fortement infestés (comme CRés) que sur des individus avec une charge parasitaire faible (comme CDir). La ponte et le rendement de ponte sont également plus bas que dans le groupe CDir, sans qu'il soit possible d'en expliquer la cause. Les effets de l'IL-2 sur la biologie des tiques ne sont pas aussi spectaculaires que lors de Ia première expérience, mais ils sont comparables. Le repas sanguin et la ponte sont en moyenne plus perturbés dans le groupe TIL-2 que dans les groupes contrôles, et le rendement de ponte y est aussi le plus bas. Ces trois paramètres, poids des Poids des tiques gorgées <50 <100 <150 <200 <250 <300 <350 mg Poids des pontes <120 <160 <200 mg c) %501 40 30-1 Rendement de ponte ? CDLr [D CRôs ¦ Tll-2 <0.2 <0.3 <0.4 <0.5 <0.6 Figure 22: Biologie des tiques. Histogrammes de fréquences _________________________RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 43 tiques, des pontes et rendements de ponte, sont représentés sous forme d'histogrammes de fréquences dans la figure 22 a,b et c. Dans chaque cas, la distribution obtenue pour le groupe TIL-2 est moins favorable aux ectoparasites que chez les contrôles: les classes de faible poids d'engorgement sont mieux représentées (<100mg); un plus grand nombre de tiques ne peuvent pas pondre ou pondent trèB peu d'oeufs; de mauvais rendements de ponte sontplus fréquents, surtout par rapport au groupe CDir. Les deux histogrammes sont d'ailleurs signifîcativement différents (p<0.05). Ces résultats confirment ainsi ceux de la première expérience avec l'IL-2. 3.2.5. Discussion L'effet bénéfique de l'IL-2 sur les phénomènes de résistance a déjà été montré dans plusieurs modèles parasitaires. Des injections d'IL-2 directement dans les nodules infectieux de patients souffrant de leishmaniose (L.aethiopica) provoquent un afflux de cellules CD4* et une diminution significative du nombre d'amastigotes dans les lésions (Akuffo et al., 1990). Chez des souris infectées par T.cruzi, une seule injection intraperitoneale de 1'5OO unités d'IL-2 suffît pour lever !'immunosuppression induite par le parasite, pour diminuer la parasitémie et prolonger la durée de vie de l'hôte (Choromanski et Kuhn, 1985). L'IL-2 humaine s'est montrée également efficace dans des cas d'infections bactériennes par Mycobacterium leprae (Kaplan et al. 1989; 1991), H.pleuropneumoniae (Anderson et al., 1987), et Listeria monocytogenes (Haak- Frendscho et at., 1989; Haak-Frendscho et Czuprynski, 1992). Dans ce dernier example, des injections intraveineuses de la lymphokine à des souris diminuent le degré d'infection et le temps de "clearance'' de l'agent pathogène. Elles améliorent également chez des souris la résistance acquise par transfert de cellules spléniques provenant d'animaux immunisés contre la bactérie. L'effet in vivo de 1TL-2 dans les système hôtes/tiques n'avait cependant jamais été étudié auparavant. Des doses très faibles de lymphokine ont été inoculées aux lapins afin d'éviter tout effet secondaire indésirable. Des doses massives d'IL-2 (3x10* unités/kg/jour) peuvent induire des dysfunctions pulmonaires, cardiaques et hépatiques graves chez les lapins (Goldblum et al., 1990; Marshall et al., 1990). Plus proche de nos conditions expérimentales, des doses de 103 unités/kg d'IL-2 recombinante humaine provoquent diarrhées et inappétence chez des porcs traités par voie intramusculaire (Anderson et al., 1987), Dans notre cas, la quantité d'IL-2 administrée aux lapins lors de la première expérience, soit 4.5ZlO3 unités par injection (10 fois), permet de renforcer la résistance développée contre les ectoparasites sans provoquer d'effets indésirables. Les doses utilisées semblent toutefois limites: leur diminution de 15% lors de la deuxième expérience (3.8xl03 unités) se traduit par une baisse importante de l'influence du traitement sur la biologie des tiques. Four cette raison, nous avons choisi de commenter principalement les résultats de la biologie des tiques récoltées lors de la première expérience, qui sont les plus nets et les plus complets. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 44 Grâce au traitement à I'IL-2, les lapins infestés par un petit nombre de tiques deviennent fortement résistants après une seule infestation déjà. En réinfestation, les altérations du repas sanguin et de la ponte sont beaucoup plus graves dans le groupe TIL-2 que dans le groupe contrôle direct CDir. La résistance des lapins TIL-2 semble même être supérieure à celle des lapins "contrôles résistants" CRés. En première infestation déjà, le poids d'engorgement et le rendement de ponte sont diminués chez les tiques nourries sur les lapins TIL-2. Nous ne pouvons exclure ici un effet toxique direct de la lymphokine sur les ectoparasites. Il est cependant peu probable car les injections d'IL-2 sont pratiquées en un point éloigné des sites de fixation des tiques et par voie sous-cutanée. De plus, la demi-vie de l'hormone dans le plasma est très courte: environ sept minutes si l'administration est intraveineuse (Lotze et al.t 1985). Les injections d'IL-2 semblent plutôt avoir un effet immédiat sur la réponse des lapins. Une meilleure activation du système immunitaire pendant la phase d'induction de la réponse (première infestation), et la formation d'un grand nombre de cellules à mémoire, peuvent expliquer le renforcement de la résistance observée lors de la seconde infestation. L'IL-2 peut agir sur la réponse à médiation humorale. Ainsi Weyand et al. (1986) signalent chez des souris une production polyclonale d'IgM en réponse à des doses massives d'IL-2. Chez des souris infectées par T.cruzi et traitées à l'IL-2, une augmentation des IgM et des IgG spécifiques est observée, qui s'accompagne d'une meilleure protection de l'hôte contre le pathogène (Choromanski et Kuhn, 1987). Dans une expérience de vaccination de bovins contre l'herpès, une élévation des titres d'anticorps spécifiques est mesurée dans le sérum des animaux ayant reçu de l'IL-2 comme adjuvant (Reddy et al., 1989). La résistance au virus conférée par le vaccin pourrait être liée à des phénomènes d'ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity), favorisés par la lymphokine. Cependant, d'autres auteurs sont moins catégoriques quant à l'effet de l'IL-2 sur la réponse humorale. Chez des cobayes immunisés contre le virus Herpes simplex, le taux d'IgG n'est pas augmenté par le traitement (Weinberg et Merigan, 1988). Nunberg et al. (1989) mentionnent des résultats similaires avec des souris vaccinées contre la rage et traitées avec la lymphokine. Enfin, Kawashima et Platt (1989) observent bien une élévation des titres d'anticorps due à l'IL-2 chez des porcs vaccinés contre un virus pseudorabique, mais sans obtenir un effet protecteur accru. Dans notre étude, l'examen des titres d'IgM totales par immunodiffusion radiale n'apporte aucun renseignement concernant le mode d'action de la lymphokine. Rappelons que seules de très légères augmentations de concentration sont mesurées dans les groupes contrôles. Utilisant le même test d'immunodiffusion radiale, Papatheodorou ( 1984) n'a pas non plus constaté d'augmentation des IgM totales chez des lapins infestés par !.ricinus. La méthode de détection des immunoglobulines utilisée est sans doute peu sensible. Cependant, un test ELISA IgM conventionnel (résultats non présentés) ne fournit pas plus de renseignements. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 45 Les titres d'anticorps IgG mesurés chez les lapins TIL-2 paraissent inférieurs, mais ne diffèrent pas significativement de ceux des lapins CDir. Par contre, la production d'anticorps anti-ËGS du groupe TIL-2 est beaucoup plus basse que dans le groupe CRés. La réponse anticorps IgG des hôtes reste donc avant tout dépendante de la charge parasitaire (chapitre 3.1.4.; Schorderet et Brossard, 1993a). L'effet protecteur de 11L-2 ne serait pas dû, dans notre modèle» à une amplification de la réponse à médiation humorale. Dans les deux expériences, la réponse des lymphocytes à l'EGS est plus basse chez les lapins TIL-2 que chez les lapins contrôles (surtout en comparaison de CDir). Plusieurs explications sont possibles: a) Lotze et al. (1985) montrent qu'un traitement in vivo à l'IL-2 est susceptible de provoquer des modifications du nombre et de la composition des sous-populations de lymphocytes circulants, ce qui pourrait influencer les tests. b) Les lymphocytes spécifiques seraient moins nombreux dans le sang circulant, soit en raison de leur accumulation et de leur rétention dans les ganglions régionaux drainant les sites de fixation des tiques, soit à cause de leur migration plus rapide et plus massive en direction de ces sites. La réponse lymphocytaire spécifique a été vérifiée après traitement à l'IL-2 chez des cobayes infectés par H.simplex (Weinberg et Merigan, 1988) et chez des porcs vaccinés contre le virus pseudorabique (Kawasbima et Platt, 1969). Dans les deux cas, la prolifération des lymphocytes en présence d'un antigène n'est pas significativement modifiée par l'IL-2. Il est possible que le test de transformation lymphoblastique ne soit pas adéquat pour déceler un effet direct de l'IL-2 sur l'immunité à médiation cellulaire. Plusieurs auteurs (Lotze et al., 1985; Kradin et al, 1989; Reddy et ai., 1989) observent une baisse de la réponse à Ia conA chez les sujets traités. Les doses de lymphokine utilisées dans ces études sont beaucoup plus élevées que celles que nous avons choisies, et provoquent de graves effets secondaires. Par contre, et comme dans nos expériences, les doses faibles d'IL-2 ne semblent provoquer, chez des souris infestées par L. monocytogenes, aucune modification de la prolifération des lymphocytes en présence de conA (Haak-Frendscho et al., 1989). Le test dURT permet d'évaluer la réponse à médiation cellulaire de façon plus fidèle que le test de transformation lymphoblastique. En effet, la réaction requiert la présence de cellules CD4* spécifiques aux antigènes injectés (Meltzer et Nacy, 1989). Elles libèrent localement des médiateurs (MAF: macrophage activating factors) qui retiennent et activent les monocytes, véritables effecteurs de I1HRT. Sous l'effet de MAF tels que ITNF-T ou 1TL-4, ils acquièrent un pouvoir cytotoxique dirigé non spécifiquement contre tout agent pathogène présent. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 46 Dans notre étude, trois lapins traités à l'IL-2 développent des réactions d*HRT spectaculaires. DeB monocytes cytotoxiques se trouvant aux sites de fixation des tiques pourraient participer à la défense de l'hôte en détruisant des cellules intestinales des ectoparasites après avoir été ingérés. D'autres modes d'action de la lymphokine doivent cependant intervenir, puisque deux lapins traités ne présentent pas de réactions cutanées à l'EGS, bien que développant par la suite une bonne résistance anti-tiques (résultats non présentés). L'IL-2 a un rôle activateur sur d'autres cellules immunitaires, comme les cellules NK (Hefeneider et al., 1983), qui pourraient, comme les monocytes, agir directement au niveau des tissus de la tique. Cependant, une activité NK n'a pas encore été mise en évidence chez le lapin (Laybourn et al., 1990). Si elle existe, elle n'est pas décelable par les méthodes conventionnelles. Un extrait de glandes salivaires des tiques D.andersoni diminue sensiblement la production in vitro d'IL-2 par des splénocytes de souris non infestées, activés par de la con (Ramachandra et Wikel, 1992). Des Prostaglandines, en particulier la PGE3, sont présentes dans la salive des tiques (Ribeiro et al., 1992), ou sont produites par l'hôte dans les réactions inflammatoires (Goodwin et Webb, 1980). La PGE3, ainsi que lliistamine, sont des inhibiteurs de la production d'IL-2 par les cellules T (Walker et al., 1983; Dohlsten et al., 1988; Phipps et al. 1991). L'administration répétée d'IL-2 aux lapins pendant la phase d'induction de la réponse inverserait les effets inhibiteurs de ces molécules et permettrait une meilleure réponse primaire. Elle favoriserait la formation d'une plus grande quantité de cellules à mémoire assurant une réponse secondaire plus rapide et plus forte. 3.2.6. Conclusion Cette étude a permi de montrer que les injections d'IL-2 ont un effet spectaculaire sur la résistance des lapins contre les tiques: le repas et la ponte sont perturbés précocement et de manière plus importante que chez les tiques nourries sur des individus non traités. La combinaison faible charge parasitaire et traitement à l'IL-2 est efficace pour l'obtention d'animaux très résistants. Cependant, le mode d'action de riL-2 sur le système immunitaire des hôtes reste peu évident. L'IL-2 semble agir sur le compartiment cellulaire de la réponse immune, mais les indices sont faibles. L'emploi de doses de lymphokine plus élevées, une étude précise des sous-populations de cellules présentes aux sites de fixation des tiques, l'utilisation d'inhibiteurs des Prostaglandines sont des moyens qui permettraient peut-être de préciser la fonction de l'IL-2 dans le modèle lapins-tiques. I ï 1 8 S 8 S 5 5 « -a) 0«0 J ili ïll!!! SSSBSS ___________________ RÉSULTATS ET DISCUSSIONS______________47 3.3. Effets du TNF-g sur Facauisition de la résistance et sur la réponse immunitaire des lapins infestés 3.3.1. Remarque préliminaire Le TNF-a recombinant humain est biologiquement actif chez le lapin (Morimoto et al., 1989). Cette cytokine joue un rôle important dans les phénomènes inflammatoires (Warren, 1990), notamment au niveau de la peau (Beutler et Cerami, 1989). La piqûre des tiques provoque une inflammation locale de la peau, laissant présumer une intervention de cette cytokine dans les relations hôte/tiques. Notre modèle rend difficile une analyse directe des facteurs produits aux sites de fixation des ectoparasites, en raison du peu de réactifs spécifiques de lapin disponibles sur le marché. Noub avons donc choisi d'intervenir de manière systémique sur l'hôte afin d'observer les modifications éventuelles de sa réponse. Dans un premier temps, la neutralisation du TNF-a a été recherchée par une vaccination des hôtes contre la cytokine. L'effet de cette neutralisation a été mesuré sur la biologie des tiques et sur la réponse immunitaire des lapins. Dans un second temps, les effets directs de la cytokine sur la biologie des tiques et la réponse des hôtes ont été mesurés. Ainsi, du TNF-a a été injecté aux lapins par voie intraveineuse pendant les infestations. Chez des souris traitées de cette manière, 30% de la dose de TNF-a injectée se retrouve accumulée au niveau de la peau après huit minutes (Beutler et al., 1985c). 3.3.2. Vaccination contre le TNF-a 3.3.2.1. Titres d'anticorps anti-TNF-a Après le premier rappel (Rl, figure 23), deux lapins vaccinés (3 et 4), présentent déjà une élévation significative de leur titre d'anticorps anti-TNF-a (p<0.001). Dès le second rappel (R2), la production est significative chez tous les animaux. Elle augmente encore après le troisième rappel (R3). Les titres dépassent alors les valeurs obtenues avec le sérum commercial (voir annexe IV), et sont suffisamment élevés pour procéder à la première infestation. Lors de la prise de sang effectuée une semaine après la fin de celle-ci (Infi), les titres d'anti-TNF-a marquent une baisse chez tous les lapins. Un quatrième rappel (R4) les stabilise, alors qu'une seconde infestation s'accompagne d'une nouvelle diminution des taux d'anti-TNF-a chez tous les animaux, à l'exception du vacciné n°3. Aucune production d'anticorps dirigés contre la cytokine n'est détectée chez les lapins témoins. 3.3.2.2. Réponse humorale contre I1EGS Après le premier contact avec les tiques (Inf 1, figure 24), l'élévation du 4On I ' I témoins 30- vaccinés itJàk R2 R3 Inf 1 Inf 2 Prise de sang Figure 26: Transformation lymphoblastique. Réponse à l'EGS Moyennes ± SB. Voir figure 23 pour les légendes R3 Inf 1 R4 Inf 2 Prise de sang Figure 27: Transformation lymphoblastique. Réponse à la conA Moyennes ± SB. Voir figure 23 pour les légendes RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 43 titre d'anti-EGS est significative dans les deux groupes de lapins (p<0.001). La seconde infestation entraîne une nouvelle production d'IgG spécifiques, sans différence statistique entre les lapins vaccinés et les témoins. 3.3.2.3. C3 sérique Comme les anticorps anti-EGS, le taux de C3 sérique est vérifié tout au long de l'expérience (figure 25, page précédente). La première prise de sang effectuée après Ie premier rappel (Rl), révèle une augmentation de la concentration de C3 dans le sérum des lapins vaccinés. Elle devient significative par rapport à Ia mesure effectuée avant le début de la vaccination (C) dès le second rappel (p<0.01). Elle va le rester jusqu'à la fin de l'expérience, ceci malgré une légère diminution du taux de C3 après le troisième rappel (R3) et la première infestation (Inf 1). Dès le début du traitement, le taux de C3 sérique des lapins vaccinés est significativement plus élevé que celui des animaux témoins (p<0.001). Ce dernier varie peu pendant la durée de l'expérience. 3.3.2.4. Réponse cellulaire des lapins: analyse par transformation lymphoblas tique 3.3.2.4.1. Remarque La réponse lymphocytaire des lapins n'est pas mesurée à chaque prise de sang, les prélèvements pratiqués après les rappels servant surtout à vérifier les titres d'anticorps anti-TNF-a. 3.3.2.4.2. Réponse à fEGS Le premier test est effectué après le second rappel (R2, figure 26). La réponse lymphocytaire est meilleure en moyenne chez les lapins vaccinés que chez les animaux témoins, alors qu'il n'ont pas encore été infestés. Après le troisième rappel (R3), la situation reste identique à la prise de sang précédente, bien que la prolifération soit un peu plus faible dans le groupe vacciné. Le contact avec les tiques (Inf 1 et Inf 2) induit une augmentation progressive de la réponse à I1EGS dans le groupe témoin. Dans le groupe des vaccines, la prolifération lymphocytaire est plus élevée lors de la première infestation. Aucune des différences observées entre les groupes ou les prises de sang n'est statistiquement significative, probablement en raison du peu de lapins et de la variabilité des résultats. 3.3.2.4.3. Réponse à la conA La réponse lymphocytaire des lapins témoins reste inchangée durant toute l'expérience (figure 27). Par contre, d'importantes variations sont observées chez les lapins vaccinés. La prolifération mesurée après les second et quatrième rappels (R2 et R4) est significativement plus élevée que lors des autres prises de sang (R3, Inf 1 et Inf 2; p<0.05). La réponse est alors supérieure en moyenne à celle des témoins. Le nombre de données est à nouveau trop petit pour mettre en évidence une différence significative entre les deux groupes de lapins. Vaccinés Témoins 1ère infestation (n=4) (n=3) Temps de gorgement (jours) 6.7 ± 0.9 (94) 7.0 ±1.0 (67) Poids des tiques gorgées (mg) 188.9 ±99-5 (94) 214.3 % 64.2 (67) Nutrition perturbée (tiques <100 mg) 21.3% (20) " 4.5% (3)" Fréquence de ponte (%) 80.9% (76) 91.0% (61) Poids des pontes (mg) 90.7*46.6 (76) 97.4 ± 36.0 (61) Rendement de ponte 0.40*0.13 (76) 0.43 ± 0.11 (61) Fréquence d'éclosion des pontes (%) 79.0% (60) 77.1% (47) 2ème infestation Vaccinés Témoins Temps de gorgement (jours) c 7.5 ± 1.5 (87) c 7.8 ± 1.6 (64) Poids des tiques gorgées (mg) c 138.9 ± 88.6 (87) d 131.7 ± 67.2 (64) Nutrition perturbée (tiques <100 mg) a 37.9% (33) c 29.7% (19) Fréquence de ponte (%) 82.8% (72) 79.7% (51) Poids des pontes (mg) b 65.0 ±43.3 (72) d 52.6 ± 33.3 (51) Rendement de ponte a 0.37 ±0.12 (72) d 0.34 ± 0.13 (51) Fréquence d'éclosion des pontes (%) 88.9% (64) 66.3% (44) Moyennes * éc.-t. ou % ": p<0.001 a: nombre de lapins a: ikO.05; b: p<0.01; c: p<0.001; ( ): nombre de tiques d: [xO.0001: entre infestation I et 2 Tableau 8: Biologie des tiques aï %40i <50 <100 <150 <200 <250 <300 <350 <400 mg I | témoins H| vaccinés <50 <100 <150 <200 <250 <300 <350 mg I 1 témoins Hi vaccinés Figure 28: Histogrammes de fréquences. Poids dea tiques gorgées. a) 1ère infestation b) 2ème infestation RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 49 3.3.2.6. Biologie des tiques Le tableau 8 présente la biologie des tiques de manière globale. En première infestation, les différences entre les lapins vaccinés et les témoins sont faibles, à l'exception du nombre de tiques de moins de lOOmg qui est significatìvement plus élevé chez les lapins vaccinés (voir tableau pour les valeurs de p). Les moyennes du poids des tiques gorgées, du poids des pontes et du rendement de ponte sont aussi plus basses dans ce groupe. En seconde infestation, les lapins des deux groupes développent une résistance. Le poids des tiques et des pontes, ainsi que le rendement de ponte diminuent significatìvement. Le nombre de tiques pesant moins de lOOmg augmente et le temps de gorgement est prolongé. Par contre, les fréquences de ponte et d'éclosion sont peu modifiées. Les deux groupes ne sont pas différents statistiquement, avec toutefois plus de tiques dont la nutrition est perturbée sur les lapins vaccinés. Les données concernant le poids des tiques gorgées sont analysées plus en détail au moyen d'histogrammes de fréquences. La distribution en classes du poids des tiques de première infestation (figure 2Sa) diffère significatìvement d'un groupe à l'autre (p<0.01). On constate un nombre plus grand de tiques pesant moins de lOOmg dans le groupe vacciné (voir aussi tableau 8). A Ia deuxième infestation (figure 28b), la distribution des poids est décalée vers les valeurs faibles, signe de l'apparition d'une résistance chez les lapins des deux groupes. Le phénomène paraît plus accentué chez les témoins, où aucune tique ne pèse plus de 300mg au détachement Les deux histogrammes ne sont pas statistiquement différents. 3.3.3. Remarques Les différences de réponse immunitaire observées entre les animaux vaccinés et les témoins (concentration de G3 sérique, réponse lymphocytaire à I1EGS et à la conA) sont vraissemblablement dues à l'action directe du TNF-a injecté lors de la vaccination, plutôt qu'à la neutralisation de la cytokine. Les titres de C3 sérique augmentent significatìvement chez les lapins vaccinés dès le second rappel. Or, il est connu que le TNF-a est capable d'activer la production hépatique de G3 (Fepys, 1992). Dans les tests de transformation lymphoblastique, les lymphocytes des lapins vaccinés montrent une plus grande capacité d'actdvation face à I1EGS et à la conA. Les cellules répondent intensément aux antigènes de tiques bien avant la première infestation, ce qui n'est pas le cas pour le groupe témoin. La prolifération des lymphocytes en présence de conA est aussi généralement plus élevée dans le groupe vacciné. Cet état d'activation pourrait être dû au TNF-a lui-même, car cette cytokine peut augmenter directement, du moins in vitro, la prolifération de lymphocytes T en réponse à des antigènes ou des mitogenes (Yokota et al., 1988). 31 38 Jour W2 Figure 29: Réponse IgGanti-EGS mesurée par ELISA Moyennes ± SE I I témoins ^l traités 31 38 Jour mi 2 Figure 30: Immunodiffusion radiale. IgM totales. Moyennes ± SE. %SO0-i X I I témoins 400- I Hi ^ites 300 I ^ 200- H-i I J JJ^ I^ 100- 1 I I ri I 0- LU -2 T hi î LU 12 LU 25 31 W2 38 Jour Figure 31: Immunodiffusion radiale. C3 sérique. Moyennes ± SE. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 50 Les effets modérés du traitement sur la biologie des tiques résulteraient d'une action antagoniste des anticorps anti-TNF-a et de la cytokine elle-même. Le traitement des lapins par injection de TNF-a pendant les infestations complétera l'expérience de vaccination tout en facilitant l'interprétation des résultats. 3.3.4. Traitement avec le TNF-a 3.3.4.1. Remarque préliminaire Le traitement des animaux avec du TNF-a recombinant humain n'a pas entraîné de production d'anticorps spécifiques, qui auraient pu neutraliser les effets de la cytokine et fausser les résultats. Cette expérience est, par conséquent, opposée à la précédente. 3.3.4.2. Réponse humorale contre l'EGS Les injections de TNF-a n'ont pas d'effet sur la réponse IgG des lapins aux antigènes de tiques (figure 29). Les deux groupes de lapins ont des titres équivalents durant toute l'expérience. H en est de même pour la production d'IgM totales (figure 30). 3.3.4.3. CSsérique Les variations du taux de C3 sérique observées durant l'expérience ne semblent pas dépendre du traitement au TNF-a (figure 31). La présence des tiques sur les hôteB (jours 5 et 31) provoque une élévation temporaire de la concentration de C3 dans les sérums des témoins, qui est significative au jour 5 par rapport à la mesure effectuée avant le début de l'expérience (jour -1, p<0.05). Dans le groupe traité, l'augmentation du taux de C3 est également significative au jour 5 (p<0.001), mais un mftTiirwrn est atteint au jour 12 de l'expérience, soit après le détachement des tiques de première infestation et la fin des injections de cytokine (p<0.001). Pendant la seconde infestation (jour 31), un nouveau pic de concentration est mesuré dans les deux groupes (p<0.001 par rapport au jour -1). 3.3.4.4. Réponse cellulaire des lapins: transformation lymphoblastique 3.3.4.4.1. Réponse à l'EGS La réponse lymphocytaire à l'EGS des lapins traités est plus élevée en moyenne que celle des lapins témoins (figure 32, page suivante). Cependant, le nombre de données à disposition n'est pas suffisant, compte tenu de la dispersion des résultats, pour mettre en évidence une différence statistique entre les deux groupes. Si l'on se réfère aux expériences précédentes, les proliférations mesurées au jour 5 (première infestation) semblent anormalement basses pour des lapins infestés par 20 paires de tiques adultes. D'autre part, la réponse cellulaire à l'EGS diminue à la seconde infestation (jour 31), ce que nous n'avions jamais observé jusqu'à présent. Figure 32: Transformation lymphoblastique. Réponse à l'EGS. Moyennes ± SE. 31 Jours < tnf2 Figure 33: Transformation lymphoblastique. Réponse à la conA. Moyennes * SE. I I tômoins traités 3t Jour Inf 2 Figure 34: Migration de neutrophiles en présence de SAct. Moyennes ± SE. EU Si contrôles avec HBSS RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 51 3.3.4.4.2. Réponse à la conA Contrairement à l'expérience de vaccination, la réponse lymphocytaire des lapins à la conA n'est pas ici influencée par le traitement au TNF-a (figure 33). Par contre, comme dans les expériences précédentes, une baisse temporaire de prolifération est mesurée dans les deux groupes au moment des infestations (jours 5 et 31). 3.3.4.5. Réponse cellulaire des lapins: migration de neutrophiles Le traitement des lapins au TNF-a ne modifie pas le comportement de leurs neutrophiles face au facteur chimiotactique (C5a) contenu dans le sérum activé au zymosan A (SAct, figure 34). Le contact avec les tiques semble stimuler les cellules qui deviennent plus mobiles. Le nombre de neutrophiles ayant migré est significativement plus élevé pendant ou juste après les infestations (jours 5,12 et 31), qu'avant le début de l'expérience (jour -1) ou après une période libre de tiques (jour 25, p<0.05 au moins). 3.3.4.6. Biologie des tiques En première infestation, peu de différences apparaissent entre les deux groupes de lapins (tableau 9, page suivante). Seul le pourcentage de tiques pesant moins de lOOmg est beaucoup plus faible dans le groupe de lapins traités que dans Ie groupe témoin (voir tableau pour les valeurs de p). Ceci influence la moyenne du poids des tiques gorgées, plus élevée de 13% dans le groupe traité, ainsi que Ia fréquence de pontes. Les autres paramètres mesurés sont, par contre, équivalents dans les deux groupes. A la seconde infestation, les lapins des deux groupes sont résistants. Cependant, les tiques nourries sur les lapins traités se sont gorgées significativement plus vite et sont plus grosses que celles des animaux témoins. Le poids et le rendement de ponte sont également plus élevés dans le groupe traité. Enfin, l'embryogenèse n'est perturbée que dans le groupe témoin. Afin de détailler un peu plus les résultats, l'histogramme de fréquences du poids des tiques gorgées est analysé. La distribution en classes du poids des tiques de première infestation (figure 35a, page suivante) illustre IeB résultats du tableau 9. Les classes de poids élevés sont mieux représentées dans le groupe traité que dans le groupe témoin. En deuxième infestation (figure 35b), Ia courbe de répartition obtenue pour Ie groupe témoin est fortement décalée vers les poids légers. Dans le groupe traité, le phénomène est moins marqué: le poids des tiques gorgées dépasse souvent 200mg. 3JI.4. Discussion La production d'anticorps contre l'EGS n'est pas modifiée par la vaccination as>Ü- TNF-ci, ni par les injections de TNF-a au cours des infestations. L'influence de la cytokine surla réponse à médiation humorale semble varier en fonction de son mode Traités Témoins 1ère infestation (n=5) (n=2) Temps de gorgement (jours) 7.5 ±1.5 (91) 7.6 ±1.6 (36) Poids des tiques (mg) 207.6 ± 84.2 (91) 180.7 ±96.7 (36) Nutrition perturbée (tiques <100 mg) 11.0% (10) [*] 25.0% (9) ['] Fréquence de ponte (%) 92.3% (84) 83.3% (30) Poids des pontes (mg) 81.8 ±38.5 (84) 82.4 ±37.9 (30) Rendement de ponte 0.36 ± 0.10 (84) 0.37 ±0.11 (30) Fréquence d'éclosion des pontes (%) 96.4% (81) 96.7% (29) 2ème infestation Traités Témoins Temps de gorgement (jours) c 8.4 ± 1.4 (52)* C 9.1 ± 1.1 (22) • Poids des tiques (mg) d 114.7 ±78.6 (52) C 82.6 ±42.4 (22) Nutrition perturbée (tiques <100 mg) d 50.0% (26) b 63.4% (14) Fréquence de ponte (%) b 73.1% (38) 63.4% (14) Poids des pontes (mg) c 52.5 ±43.1 (38) t'J c 27.7 ± 20.7 (14) [*] Rendement de ponte 0.32 ± 0.12 (38) [•] b 0.24 ± 0.14 (14) [*J Fréquence d'éclosion des pontes (%) 92.1% (35)' b 64.3% (9) * Moyennes ± éc.-t. ou % ': p<0.05 n: nombre de lapins [•]: 0.05ili" 12 Figure 45: Migration de neutropniles en présence de HBSS et de salive. Rapport: HBSS + salive/ HBSS seul. Moyennes ± SE. |ig/puit3 10 *'MÉi&î *** 5 __ •* . 2 H . 0.5 ^ -- f . 0.1 .>¦- " • ; \ . 0.01 _— -"i .3 .6 1.2 1.5 1.8 Figure 46: Migration de neutropniles en présence de SAct et d'ET. Rapport: SAct +ET/ SAct seul. Moyennes ± SE. •• p<0.01; *" p<0.001. Figure 47: Migration de neutropniles en présence de HBSS et d'ET. Rapport: HBSS + ET/ HBSS seid. Moyennes ± SE. Vig/puits S 2 EF^ —rj. ¦ Lapins wnsWIséa 1 0.2 -3— 0.05 0.01 i----------_ .5 1 1.5 Figure 48: Migration de neutrophiles. Effet du contact de l'hôte avec les tiques. Rapport: SAct + EGS/ SAct seul. Moyennes * SE. lig/puils 10 . !----- ? Lapins Indemnes ¦ uptntMn&Wtseï 5 K ? \— 0.5 0.1 0.01 ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ ' I- .5 1.5 Figure 49: Migration de neutrophilea. Effet du contact de l'hôte avec les tiques. Rapport: SAct + ET/ SAct seul. Moyennes ± SE. iii/puhs 1 H-I Lapins indomnoB ¦ Laotr» aonslbaisés Figure 50: Migration de neurophiles. Effet du contact de l'hôte avec les tiques. Rapport: SAct + salive/ SAct seul. Moyennes ± SE. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 59 Dans le cas de l'ET, seules les concentrations de 5 et lOug/puits diminuent significativement la migration en présence de SAct (figure 46, page 58). L'extrait en présence d'HBSS semble activer la motilité des cellules (figure 47, page 58). L'inhibition de la migration des neutrophiles provoquée par les extraits antigéniques est dépendante d'un contact préalable des lapins avec les tiques. Ainsi, l'effet inhibiteur de l'EGS et l'ET sur la migration des cellules est plus important lorsque celles-ci proviennent de lapins sensibilisés (p<0.05, figures 48 et 49). En ce qui concerne la salive (figure 50), l'inhibition semble au contraire plus prononcée sur les cellules des lapins indemnes (effet non significatif). La migration des neutrophiles face au HBSS en présence d'EGS et d'ET (figure 51a et b, page suivante) paraît plus intense pour les animaux indemnes. Alors que le test effectué avec la salive montre à nouveau une tendance inverse (figure 51c). Cependant, vu l'importance des variations individuelles, aucune des différences observées n'est statistique. N.B. L'inhibition de la migration provoquée par les antigènes n'est pas due à un effet toxique. La viabilité des cellules, testée avec le Bleu de Trypan, n'est pas diminuée par les antigènes aux concentrations utilisées. 3.4.4. Discussion Certaines des expériences relatées dans ce chapitre complètent les tests de transformation lymphoblastique réalisés précédemment pour suivre l'évolution de la réponse cellulaire des hôtes. Incubés sans mitogene, l'EGS et la salive ne stimulent pas les cellules d'animaux indemnes. En présence de conA, l'EGS induit une diminution significative de la réponse de ces mêmes lymphocytes à partir de 4ug/puits. Ramachandra et Wikel (1992) observent ce type d'inhibition sur des lymphocytes spléniques de souris avec un extrait de glandes salivaires de femelles de D.andersoni. La baisse de prolifération est d'au moins 50% pour des extraits prélevés aux jours 1 à 9 du repas sanguin, et testés à la concentration de lug/puits. Les auteurs mettent ces résultats en rapport avec l'inhibition de la réponse à Ia PHA observée avec des cellules prélevées chez des cobayes infestés par D.andersoni (Wikel, 1982c). Le parallèle est tentant puisque nous avons également remarqué une diminution temporaire de la prolifération des lymphocytes en présence de conA chez des lapins en cours d'infestation. Cependant, dans notre test in vitro, à des concentrations équivalentes (4ug/puits et lOug/puits), l'EGS n'inhibe pas les lymphocytes de lapins sensibilisés aux tiques. Utilisé sans conA, il stimule même ces cellules. L'effet de cet extrait antigénique sur les lymphocytes est donc très différent selon qu'ils proviennent d'un animal indemne ou sensibilisé. b) ug/puüs 10 5 2 0.5 0.1 0.01 ¦r-> I O Leon» iMemnw ¦ Uoina temiblsés I P 10 15 20 25 c) ^I/putts 1 Q Lapin» (ndomnes ¦ Lapins MNttfbiii*6s 12 16 20 Figure 51: Migration de neutrophiles. Effet du contact de l'hôte avec les tiques. Rapport: HBSS + antigène/ HBSS seul. Moyennes ± SE. a): EGS; b): ET; c): salive. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 60 La salive stimule les lymphocytes de lapins sensibilisés, mais n'induit pas de diminution de la réponse à la conA but les cellules de lapins indemnes comme pour I1EGS. Les deux extraits sont sans doute apparentés du point de vue biochimique et antigénique. Cependant, 1*EGS contient des protéines normalement absentes de la salive sécrétée, comme des protéines de structure qui pourraient être inhibitrices. La salive de I.dammini inhibe la prolifération et la production dlL-2 d'un hybridôme de cellules T stimulé par des anticorps anti-Thy-1 (Ribeiro et al., 1985). Selon ces auteurs, la suppression serait principalement due à la PGE2 salivaire. Cette substance n'a pas encore été démontrée dans la salive de !.ricinus. Il se pourrait aussi que les volumes de salive utilisés soient trop faibles pour provoquer un effet équivalent à IT3GS ou à la salive d'I.dammini. Contrairement aux deux autres antigènes, l'ET a un effet faiblement mitogénique pour IeB lymphocytes de lapins indemnes, mais qui est négligeable en comparaison de la réponse obtenue avec les cellules des animaux sensibilisés. En présence de conA, l'ET influence peu les résultats. Seule la concentration de 20ug/puits diminue la prolifération des lymphocytes de lapins indemnes. Les résultats des tests de migration des neutrophiles varient considérablement d'un individu à l'autre. Pourtant, les effets statistiquement confirmés sont intéressants. Les extraits de tiques provoquent une diminution significative de la migration des neutrophiles en présence de SAct. Le phénomène est dépendant du statut de l'hôte (indemne ou sensibilisé), car l'inhibition est plus élevée avec des neutrophiles de lapins sensibilisés aux tiques. La réponse des neutrophiles d'animaux sensibilisés à un parasite, en présence d'un facteur chimiotactique non spécifique, diffère selon le modèle étudié. La migration de neutrophiles et de macrophages de souris infectées par Echinococcus multilocularis est progressivement inhibée à mesure que l'infection se développe (Alkarmi et Behbehani, 1989). Par contre, des neutrophiles de souris infectées par Trichinetla pseudospiralUs ont une activité plus élevée et sont plus nombreux à migrer que des neutrophiles de souris indemnes (Shupe et Stewart, 1991). Ribeiro et al. (1990) ont étudié les effets de la salive d'I.dammini sur des neutrophiles péritonéaux de rat. Celle-ci inhibe l'agrégation des cellules, induite in vitro par des anaphylatoxines, ainsi que leur activation, ce qui pourrait faciliter le repas sanguin des tiques. Cette salive possède d'ailleurs une activité anti-anaphylatoxique (Ribeiro et Spielman, 1986). Dans le cas à'Lricinus, l'inhibition observée avec la salive et l'EGS pourrait, de façon similaire, être due a une inactivation du C5a, facteur chimiotactique du SAct. Un effet direct des antigènes sur les neutrophiles est aussi envisageable car l'inhibition est un peu plus accentuée lorsque l'antigène est incubé avec les cellules plutôt qu'ajouté au SAct (résultats non présentés). a) 1.2n tnf-2S Inf 5 FCS LIO L23 L36 JJ___14 120 L32 Lapins TIL-2 CDIr CRês Figure 52: Effet de serums sur des lymphocytes de lapina indemnes, en présence de conA. a) Sémms de l'expérience "charge parasitaire" (chap. 3.1.4.) b) Sémms de l'expérience "IL-2" (chap. 3.2.2.) Les résultats sont exprimés par rapport à la prolifération obtenue avec le FCS. PSl : prise de sang faite avant expérience. Les autres PS ont été effectuées selon le protocole décrit dans les expériences 3.1.4. et 3.2.2. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 61 H est difficile de déterminer ici quel protagoniste, de l'hôte ou de la tique, ce phénomène inhibiteur favorise. D'autre part, I1EGS et la salive sont chimiotactiques pour les neutrophiles (voir figures 44 et 45). Nous pourrions conclure que les antigènes injectés par les ectoparasites attirent les neutrophiles aux sites de fixation, puis les empêchent de recirculer. La présence de neutrophiles aux alentours du rostre des tiques, intervenant dans la formation d'une cavité de nutrition, n'est pas défavorable à ces ectoparasites (Tatchell et Moorhouse, 1970). 3.5. Effets du sérum de lapins sensibilisés aux tiques sur la prolifération de lymphocyte« H'nnimaux Indemnes ou sensibilisés 3.5.1. Remarque Des essais préliminaires effectués avec les serums de quelques lapinB des expériences décrites aux chapitres 3.1.4 (figure 52a) et 3.2.2. (figure 52b) montrent que les sérums prélevés pendant l'infestation des animaux (ps3, ps5 ou ps6) diminuent en général la réponse à la conA de lymphocytes de lapins indemnes de manière plus intense que les sérums prélevés avant infestation (psl). Ce phénomène ne semble pas dépendre de la charge parasitaire appliquée aux lapins. Les résultats obtenus sont généralement plus bas avec les sérums des lapins qu'avec le FCS (rapport égal à 1 sur les figures). Afin de compléter et de préciser ces observations, tous les sérums de l'expérience "111-2" (chapitre 3.2.4.) ont été testés. Selon le protocole décrit précédemment (chapitre 2.4.3), les lapins de cette expérience ont été soumis à quatre prises de sang successives: avant infestation (psl), pendant le repas des tiques (ps2), juste après ìa fin de l'infestation (ps3), et une dernière prise après 25 jours d'expérience (ps4). Pour une même prise de sang, les résultats individuels sont similaires. Hs ont été groupés pour l'analyse statistique. Seules les moyennes et les erreurs standards sont présentées dans les figures 53 et 54. 3.5.2. Effet sur des lymphocytes de lapins indemnes La prolifération en présence de conA est significativement plus basse si les tests sont effectués avec les sérums des lapins au lieu du FCS (p<0.001) (barres claires, figure 53, page suivante). Les sérums prélevés en cours d'infestation (ps2), ou juste après (ps3) ont un effet inhibiteur sur les lymphocytes significativement plus grand que les sérums des prises de sang psl et ps4 (p<0.05). 1.5i pSl ps2 ps3 ps4 Mae de sang I I sérum normal H sérum inactive Figure 53: Comparaison des résultats obtenus avec les'sérums avant et après inactivation par Ia chaleur, avec des cellules de lapins indemnes. Moyennes ± SE des proliférations mesurées en présence de conA pour chaque prise de sang. Résultats exprimés par rapport au FCS. 1.25-1 4 FCS I_____._____¦______1 1 ' .75- I I I I .5- J ¦ -¦-¦ .25-n ri Ir U i < i • ps1 ps2 ps3 ps4 Prise de sang ? sôa m normal ¦ sérur n inactivé Figure 54: Comparaison des résultats obtenus avant et après inactivation des sérums à Ia chaleur, avec des cellules de lapins sensibilisés, en présence d'EGS. Moyennes± SE des proliférations mesurées pour chaque prise de sang. RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 62 Après un chauffage à 560C pendant 30 minutes, les mêmes sérums sont ajoutés aux cultures de lymphocytes de lapins indemnes en présence de conA (barres foncées, figure 63). Le traitement a pour conséquence une augmentation généralisée de la prolifération. Seules les données concernant la prise de sang ps2 restent signifîcativement inférieures à celles obtenues avec le FCS (p<0.01). Elles sont également plus basses que les valeurs mesurées pour les trois autres prises de sang (p<0.05). D'autre part, les sérums prélevés en ps4 Btimulent signifîcativement la réponse des lymphocytes par rapport aux sérums des autres prises de sang (p<0.05 au moins). Une comparaison des résultats avant et après inactivation (figure 53) montre que la réponse des cellules est signifîcativement augmentée lorsque les sérums ont été préalablement chauffés (p<0.001). Seul l'effet inhibiteur observé en ps2 (prise de sang effectuée pendant l'infestation) demeure. 3.5JL Effet sur des lymphocytes de lapins sensibilisés L'effet des sérums sur les lymphocytes d'animaux sensibilisés est contrôlé en présence d'EGS. La figure 54 (barres claires) montre que les sérums inhibent fortement la réponse spécifique des cellules à l'antigène, en comparaison des résultats obtenus avec le FCS (p<0.001). Mais contrairement à ce que nous avions observé au paragraphe précédent, les valeurs mesurées pour chaque prise de sang ne sont pas différentes entre elles. L'inhibition semble ici totalement indépendante du contact avec les tiques, puisqu'elle est déjà présente avec les sérums psi, prélevés sur les lapins indemnes, et n'est pas accentuée avec les sérums des prises de sang suivantes. Le chauffage des sérums à 56°C rétablit la prolifération des cellules à un niveau comparable à celui observé avec le FCS (barres foncées, figure 54). L'activité inhibitrice des sérums semble ici entièrement thermolabile. Les résultats sont ainsi signifîcativement plus élevés que pour des sérums sans traitement à la chaleur (p<0.001). 3.5.4. Discussion Le sérum des lapins inhibe, quel que soit le moment de Ia prise de sang, la prolifération de lymphocytes de lapins indemnes ou sensibilisés. Leur inactivation par la chaleur rétablit généralement une réponse lymphocytaires à la conA et à 1*EGS comparable à celle obtenue avec du FCS. L'inhibition serait principalement due à l'action sur les lymphocytes de facteurs thermolabiles, dont font partie certains composants du système complément. Cependant, si l'on se réfère aux résultats concernant les prises de sang ps2 et ps3 en présence de conA, d'autres facteurs RÉSULTATS ET DISCUSSIONS 63 suppresseurs, résistants à la chaleur, semblent circuler dans le sang des lapins pendant les infestations, et disparaître progressivement après la fin du repas sanguin. Des principes inhibiteurs, insensibles à un traitement à la chaleur à 560C1 ont aussi été démontrés dans les plasmas de patients parasités par Schistosoma monsoni (Kamal et Higashi, 1982). Les auteurs incriminent des complexes immuns non spécifiques ou spécifiques dans l'inhibition de la réponse mitogénique de lymphocytes humains non sensibilisés. Dans le cas de bovins infectés par Mycobacterium johnei (Johne's disease), Davies et al. (1974) situent l'activité inhibitrice dans une fraction sérique riche en IgG. La suppression observée serait due à l'action d'auto-anticorps. Pour Hirsh et al. (1975), l'effet inhibiteur des sérums de chiens souffrant d'une démodicose généralisée pourrait être attribuée soit à un facteur sérique inconnu, soit à des complexes antigènes-anticorps. Cet effet disparaît à la rémission de la maladie. Dans notre expérience, une activité inhibitrice thermostable est présente au moins au cinquième jour de Ia première infestation (ps2), ce qui rend aléatoire la participation des IgG au phénomène. D'autres facteurs pourraient intervenir, tels que des complexes immuns non spécifiques, des substances contenues dans la salive des tiques, ou des médiateurs produits par les hôtes en réponse à la piqûre des ectoparasites (Prostaglandines, par exemple). Le principe inhibiteur des sérums ps2 n'est observé qu'en présence de conA et avec des cellules de lapins indemnes. La réponse spécifique à I1EGS des lymphocytes d'animaux sensibilisés n'est pas affectée, ce qui nous rappelle les observations faiteB sur l'effet direct des antigènes dans les tests de transformation lymphoblastique: I1EGS, avec ou sans conA, diminue Ia prolifération de cellules de lapins indemnes, mais pas celle des lymphocytes de lapins sensibilisés. En conclusion, le sérum des lapins en cours d'infestaüon pourrait contenir un ou plusieurs facteurs capables de limiter la réponse cellulaire tout en favorisant Ie repas sanguin. Cette activité inhibitrice ne semble cependant pas affecter la réponse spécifique des lymphocytes avec les antigènes de tiques. Elle aurait peu d'effet sur les mécanismes d'induction de la résistance et sur la phase effectrice de la réponse immunitaire anti-tiques. Discussion générale et conclusions 64 4. Discussion générale et conclusions Les résultats de ce travail ont permis de montrer que: a) Le degré de résistance des lapins, ainsi que leurs réponses cellulaire et humorale, sont dépendants de la charge parasitaire. Celle-ci détermine aussi la rapidité avec laquelle les hôtes développent une forte résistance contre les ectoparasites. b) L'IL-2 joue un rôle central dans l'acquisition d'une forte résistance anti-tiques par les lapins. Elle contrôle l'activation des cellules effectrices importantes pour la protection dé l'hôte, tout en initiant des perturbations du cycle de vie des ectoparasites. c) Le TNF-ct, composant important des réactions inflammatoires cutanées, semble faciliter le repas sanguin des tiques, et perturber la mise en place des mécanismes de résistance. d) La glande salivaire d'I.ricinus contient des principes inhibiteurs de la prolifération in vitro des lymphocytes d'animaux indemnes à la conA, et de la migration des neutrophiles, ce qui pourrait in vivo favoriser le repas sanguin des tiques. Par contre, la réponse des lymphocytes d'animaux sensibilisés est stimulée par les antigènes salivaires. Ainsi, ces substances n'ont pas d'effet sur la réponse spécifique des hôtes. Elles ne semblent pas perturber le développement normal de la résistance. La réponse du lapin face aux tiques peut être considérée comme la somme de phénomènes inflammatoires (généralement non spécifiques), et immunitaires (spécifiques). La figure 65 (page suivante), modifiée d'après Kaufman (1989), présente un essai de synthèse des réponses dans le modèle /.ricmus/lapin, sur lequel est basée la discussion générale de nos résultats. a) En primoinfestation, les tiques fixées à l'hôte provoquent une réaction inflammatoire caractérisée principalement par une infiltration massive de neutrophiles, qui sont responsables de la formation d'une lésion de nutrition (Tatchell et Moorhouse, 1970; Brassard et Fivaz, 1982). La réponse inflammatoire non spécifique semble plutôt favorable aux tiques qui prélèvent des quantités de sang importantes, et présentent des rendements de ponte élevés. Cette réponse semble même être nécessaire aux ectoparasites. Les résultats de l'expérience 3.1, sur les A) La tique so Ute sur fhdt« y Dégât« ~^r tissu taire« Captés par le* cellules présentatrices ^^- d'antigènes I Sécrète des antigènes * Ag présentés aux lymphocytes T * Activation des lymphocytes T Activation des lymphocytes B * i Sécrétion de médiateurs par Ifs »Dûtes résidentes g C0nM^gn ? 4,10 WnI \$M 2x1o'celVnU g>H 1^x1o'ce!Vml ¦ I xio'ces/ml HO-SxIO1CeIM b) 0.01 tig 0.1m 0.5 ug 1 MO 2 ^g 5ng corWpurts I I 4xlo'ce«ftnl d|2xlOBctìlArt [£8] 1.5x 1 o'ccflAiH ¦ lxlOeceH/ml ¦ 0.51lo'coUM Figure B: Transformation lymphoblastique. Mise au point avec le mitogene. a) cpm nets b) rapport: puits avec conA/puits témoins Annexes 74 Lavage avec HBSS/centrifugation à 340g. Si le culot est encore rouge, trois volumes de NH4CI 0.83% sont ajoutés pour provoquer une lyse des erythrocytes par choc osmotique. Après 3 minutes, les cellules sont centrifugées à 200g pendant 5 minutes. Lavage avec HBSS/ centrifugation à 200g. - Comptage Le culot est resuspendu dans un volume connu de HBSS. Le comptage s'effectue comme pour les mononucléaires. N.B. Les polynucléaires isolés sont en très grande majorité des neutrophiles. La viabilité des cellules est de 92±5%. Four des raisons pratiques, l'isolation se termine le jour après la prise de sang, ce qui pourrait expliquer la viabilité légèrement inférieure à celle observée pour les L+M. ANNEXE ni: Tests cellulaires A. Transformation lymphoblastique Ce test permet de contrôler l'état général de la fonction lymphocytaire par l'utilisation d'un mitogene, ainsi que la réponse spécifique des lymphocytes à un antigène. La reconnaissance des antigènes ou des mitogenes par les lymphocytes se traduit par une prolifération. Elle est mesurable en introduisant dans les culture un nucleotide marqué radioactivement, qui sera incorporé dans l'ADN des cellules à chaque division (Oppenheim et Schecter, 1976; Kristensen et al., 1982). Mise au point La prolifération des lymphocytes en présence de concentrations croissantes d'un mitogene ne suit pas une progression linéaire (exemple figure B). Pour une concentration de cellules donnée, une concentration de mitogene trop faible n'aura aucun effet stimulateur, alors qu'une concentration trop forte sera toxique et résultera également en une prolifération nulle. Il convient de choisir un couple "concentration de cellules/concentration de mitogene'' optimal, dépendant aussi du nombre de cellules à disposition pour effectuer les tests. Dans notre cas, ce nombre était relativement restreint, vu les quantités de sang limitées pouvant être prélevées sur un lapin. Annexes 75 Plusieurs mitogenes ont été testés avec les lymphocytes de lapin: • la concanavaline A (conA) - la phytohémagglutinine A (PHA) Ces deux mitogenes stimulent essentiellement les lymphocytes T. - le pokeweed mitogen (PWM), stimulant les lymphocytes T et B - le lipopolysaccharide de Escherichia coli (LPS) étant un mitogene de lymphocytes B Les résultats obtenus avec la PHA et le PWM ont montré une plus grande variabilité et étaient en moyenne deux fois moins élevés que ceux obtenus avec la conA. La prolifération avec le LPS a toujours été très basse, vraissemblablement à cause de la faible représentation des lymphocytes B dans le sang circulant. Finalement, nous avons choisi de ne travailler qu'avec la conA, qui nous semblait donner les meilleurs résultats. Les concentrations définitives pour ce test sont mentionnées dans Ie mode opératoire. Mode opératoire Le protocole général est le même pour tous les tests effectués au cours de ce travail. Les particularités inhérentes à chaque expérience sont précisées dans le chapitre "Matériel et méthodes". Pour les cultures, des microplaques de 96 puits à fond rond (Nuclon, Nunc) sont utilisées. La rangée de puits externe est remplie de HBSS pour créer un environnement stable dans la plaque. Les lymphocytes sont répartis dans les autres puits à la concentration de 1.5xlOB cellules dans un volume final de 10OuI de RPMI complet (tableau B, verso page 72). Les cultures sont stimulées par des extraits protéiques de tiques (EGS ou ET) ou (et) par 0.5 ug/puits de conA. Les puits sans addition de réactifs aux cellules servent de témoin. Les tests sont toujours effectués sous forme de triplicata. Après 72 heures dlncubatìon à 37°C sous 5% de CO3, IpCi de thymidine tritiée (activité spécifique: 20-30 Cimmol'1; Amersham) est ajoutée dans chaque puits. Les cellules sont récoltées 16-18h plus tard à l'aide d'un "cell harvester" (Inotech). La radioactivité incorporée est mesurée grâce à un compteur à scintillation liquide. Les résultats sont exprimés en coups nets par minute (cpm nets): cpm nets = cpm des cultures avec antigènes ou (et) mitogenes - cpm des cultures témoins a) 1200-t 900- a (3 S 3 600- 300- 3OmIn I t 4x 106ceflrtril 60 min Z i 10 cell/ml 90 mir 15 * 10 cell/ml ,„ . Temps 120 mm (fincubation 1 x lo'cea/ml 30mtn \ 1 4x10*ceIWnl 60 mm 2M0ceMnl Temps 90 min 120 min oTncubation ¦ t.5i:oWil ¦ 1x10sc«UM Figure C: Test de migration des neutrophiles. Mise au point. a) résultats bruts b) rapport: migration avec Sact/migration avec HBSS Annexes 76 B. Migration de neutrophiles Ce test pennet d'évaluer le pouvoir acüvateur ou inhibiteur d'un réactif donné sur la migration des neutrophiles. Il s'effectue à l'aide d'une chambre de microchimiotane (Neuro Probe; Falk et al., 1980). Cette chambre est constituée de 48 puits pouvant être divisés en compartiments supérieurs et inférieurs par une membrane de polycarbonate percée de pores de 0.5um de diamètre (Nucleopore). La partie inférieure d'un puits, d'un volume de 25ul, va recevoir les réactifs, alors que celle du haut (vol. 5OpI) contiendra la suspension cellulaire. Les pores de la membrane sont légèrement plus petits que le diamètre des neutrophiles au repos. S'ils sont attirés par un réactif, ils devront traverser activement la membrane par mouvements amoeboïdes. Les cellules ayant migré sont ensuite récupérées avec la membrane, colorées et comptées. Mise au point La concentration de cellules et le temps d'incubation sont importants à déterminer. En effet* une concentration de cellules trop élevée est synonyme, si la migration est massive, de difficultés de comptage au microscope. Un temps d'incubation trop long diminue les différences entre puits tests et puits témoins: au bout d'un certain temps les cellules traversent naturellement la membrane pour occuper tout le volume du puits. De plus, si la migration active est très rapide, un certain nombre de cellules risquent de se détacher de la membrane et de tomber au fond du puits. Elles ne seront donc plus comptabilisées (figure C). Ainsi, il faut trouver la concentration de cellules de départ et le temps d'incubation adéquats permettant d'obtenir un rapport "migration avec un attractant/témoin sans attractant" élevé. La concentration et le temps d'incubation choisis sont indiqués dans le mode opératoire. Facteur cnimiotactique Du sérum de lapin (Gibco) est incubé à 37°C pendant 30 minutes avec 1% (p/v) de zymosan A (Sigma). Le zymosan A est un extrait membranaire de levure (ici Saecharomyces cerevisiae) dont la présence dans le sérum déclenche l'activation de la voie alterne du complément. Le C5a produit par ce biais est le facteur chimiotactique du sérum activé. Le zymosan est ensuite éliminé par centrifugation et le sérum activé (SAct) est conservé à -200C en aliquota. Mode opératoire La partie inférieure des puits de la chambre est remplie de 25ul de SAct ou de HBSS May-Grtlnwald: 1. Fixer au methanol 2 à 3 minutes 0.6% (p/v) dans methanol 2. Diluer le May-Grünwald 1:2 avec le PBS May-Grünwald pH 7.0: PBS NajHPO^ 20 mM KH2PO4 ISmM 3. Laisser colorer Ie frottis Oa membrane) pendant 5 minutes PBS Giemsa: Solutions stock: 4. Vider le colorant, rajouter du Giemsa A: KH2PO4 67 mM 1:10 dans PBS pour 10 minutes B: Na2HPO4 67 mM 5. Laver au PBS, puis sécher Sol. finale à pH 7.0: 38.9 ml A + 61.1 ml B Tableau C: Coloration au May-Grunwald Annexes 77 pour les puits témoins. La membrane est ensuite déposée délicatement sur les puits en évitant les bulles d'air, un coin de la membrane étant préalablement marqué pour pouvoir reconnaître la disposition des tests ultérieurement. Une garniture de silicone est appliquée pour garantir l'étanchéité du système. La partie supérieure de la chambre est posée et solidement fixée à l'aide des vis prévues à cet effet. La chambre est incubée à 37°C jusqu'à équilibre thermique avant d'ajouter les cellules. Chaque puits reçoit un volume de 50ul de la suspension de neutrophiles à la concentration de 2xl08 cellules/ml de HBSS. La chambre est incubée en atmosphère humide à 370C et 5% CO3 pendant 30 minutes. Après ce temps, Ia chambre est ouverte et la membrane récupérée. La face "côté cellules" est d'abord baignée dans du PBS puis passée sur un "wiper blade" (support muni d'une gomme d'essuie-glace), afin d'éliminer les cellules n'ayant pas traversé la membrane. L'opération est répétée plusieurs fois puis la membrane est séchée. Deux méthodes de fixation/coloration ont été utilisées: - la coloration classique au May-Grünwald (tableau C) - un kit de coloration rapide Hemacolor (Merck) Les deux méthodes donnent des résultats similaires, car le kit est également un May- Grünwald légèrement modifié. H sera préférentiellement utilisé car il est beaucoup plus rapide. La membrane est ensuite déposée sur une lame de verre, la face "côté migration" tournée vers le haut. Les cellules se comptabilisent à l'aide du microscope à un grossissement de 40Ox. Chaque test est effectué en triplicata, deux champs microscopiques sont comptés par triplicat. Une moyenne est calculée pour chaque test Les résultats sont exprimés en nombre de cellules ayant migré, ou dans le rapport nombre de cellules ayant migé en présence de SAct/nombre de cellules migrant en présence de HBSS (témoin). C. Hypersensibilité du lapin à I1EGS: test cutané Le test a préalablement été décrit par Brassard et Girardin (1985). Le ventre des animaux est rasé environ 24h avant le début du test. Les lapins sont étendus sur une planche, maintenus sur le dos, pendant la première heure du test, puis à chaque nouvelle mesure. Deux zones de peau de texture semblable sont délimitées sur le ventre des lapins à l'aide d'un feutre noir. Le premier site est réservé à l'antigène EGS (50ug dans 50ul de RFMI1640) et le second au tampon de dilution HPMI 1640 (5OuI). La réaction cutanée est évaluée par la mesure de ELISA pour antigène! de tiques PBS 10 mM pH 7.4 PBS-BSA 1%: PBS 100 ml Bovine Serum 1 g Na2HPO4 1.15 g Albumin (Sigma) KH2PO4 0.2 g NaCl 8 g PBS-BSA 0.1%: PBS 100 ml KCl 0.2 g BSA 0.1 g H2O 1000 ml PBS-Tween 0.05%: PBS 1000 ml Tween-20 (Merk) 0.6 ml ELISA pour TNF-ct PBS 10 mM pH 7.4 Na2HPO4 1.15 g KH3PO4 0.2 g NaCl 8 e PBS-Tween 0.2%: PBS-Tween-BSA 1%: PBS Tween-20 PBS-Tween 1000 ml 2 ml 100 ml KCl 0.2 g BSA 1 g H1O 1000 ml PBS-Tween-BSA 0.1%: PBS-Tween BSA 100 ml 1 g Réaction colorlmétrique Tampon diéthanolamine pH 9.8 Diéthanolamine MgCl2 x 6 H2O NaN, 19.4 ml 20 mg 40 mg Ajouter environ 160 ml d*HaO distillée, puis ajuster à pH 9.8 avec HCl 0.1N. Compléter à 200 ml avec H2O dist. para-nitrophényl-phosphate (PNPP) 1 mg/ml de tampon Tableau D: ELISA: solutions et tampons Annexes 78 l'épaississement de la peau au centre des sites ayant reçu les injections sous-cutanées d'antigène ou de tampon. Les mesures sont effectuées à l'aide d'un micromètre, toutes les dix minutes pendant la première heure du test, puis après 6, 24, 48, 72 et 96h. Une mesure faite avant les injections sert de témoin. L'épaississement net est calculé pour chaque site en soustrayant des valeurs obtenues après injection, la mesure témoin. ANNEXE IV: Tests sérologiques A. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ELISA pour la détection d'anticorps IgG dirigés contre l'EGS et I1ET Les solutions et tampons sont décrits dans le tableau D. - Sensibilisation des plaques Les antigènes de tiques, dilués dans du tampon carbonate pH 9.6 à la concentration de 2.5ug/ml pour l'EGS et de 2ug/ml pour I1ET, sont distribués, à raison de lOOul/puits, dans des microplaques en Immulon (Dynatech M 129-A). Les plaques sont recouvertes de parafilm et incubées une nuit à 4°G. - Lavages Trois lavages successifs (le premier de quelques secondes, les suivants de 5 minutes environ) sont effectués avec du PBS-Tween 0.05% pH 7.4. Chaque puits reçoit 20OuI, distribués à l'aide d'une pipette multicanaux ou d'un appareil (UltrawaBh II, Dynatech) - Saturation des sites Pour éviter la fixation non spécifique d'immunoglobulines au cours des prochaînes étapes, les Bites encore libres dans les puits sont saturés d'albumine bovine (BSA) par l'addition de 200ul/puits de PBS-BSA 1%, pendant 30 minutes à 37°C. Toutes les incubations sont effectuées dans une étuve à circulation d'air pour diminuer les effets de bord. Lavages identiques aux précédents. - Incubation des plasmas Les plasmas à tester sont dilués à 1:100 avec PBS-BSA 0.1% et répartis en Annexes 79 duplicata dans la microplaque à raison de lOOul/puits. Au moins deux puits par plaque ne reçoivent que le tampon de dilution (blancs). Le plasma d'un lapin ayant subi cinq infestations est ajouté dans chaque microplaque comme témoin positif. Les plaques sont incubées Ih à 370C. Lavages identiques aux précédents. - Anticorps secondaires Les anticorps secondaires sont des IgG de chèvre antì-IgG de lapin couplés à de la phosphatase alcaline (Kirkegaard & Perrry Lab.). Dilués à 1:1000 avec du PBS-BSA 0.1%, ils sont incubés dans les plaques Ih à 370C, à raison de lOOul/puits. Lavages identiques aux précédents. - Réaction colorimétrique Le substrat, du para-nitrophényl-phosphate (PNPP, Aldrich) dilué à lmg/ml dans un tampon diéthanolamine-HCl (pH 9.8, 0.5mM MgCl1), est ajouté à raison de 200ul/puits. L'incubation à 37°C dure de 30 à 60 minutes selon la vitesse de la réaction. Celle-ci est finalement stoppée par l'addition de 50ul/puits de NaOH 3N. - Lecture des résultats La lecture de la réaction se fait à 405nm à l'aide d'un Autoreader MR 580 (Dynatech). La valeur nulle est prise par rapport aux blancs (puits incubés sans plasmas). La moyenne des densités optiques (D.O.) des duplicata est calculée. Les résultats sont exprimés par le pourcentage que représente cette moyenne par rapport à la moyenne des D.O. obtenus pour le témoin positif. Une comparaison de titres entre des plasmas testés sur des microplaques différentes est ainsi possible. ELISA pour la détection d'IgG anti-TNF-cc humain Les solutions et tampons sont décrits dans le tableau D (verso page 77). Le mode opératoire est sensiblement le même que pour FELISA "antigènes de tiques". Les particularités du test sont indiquées ci-dessous. - Sensibilisation des plaques L'antigène utilisé est du TNF-a recombinant humain (Genentech) dilué à 0.5ug/ml dans du tampon carbonate pH 9.6. - Lavages Trois lavages identiques à ceux décrits précédemment sont effectués avec un tampon PBS-Tween 0.2% pH 7.4. Ingrédients Quantité Conc.fînale Acide 5,5-diéthylbarbiturique (barbital) C8H12NA 0.8 g 43 mM 5,5-diéthylbarbiturate de Bodium (sodium barbital) C8H11N2NaO3 4.1 g 200 mM Azide de sodium H3O distillée NaN3 1.0 g 1000 ml 150 mM Tableau E: Tampon barbital 240 mM, pH 8,6 ^g Annexes 80 - Saturation. Les sites encore libres sont bloqués avec 200ul/puits de PBS-Tween 0.2%-BSA 1%. Lavages identiques aux précédents. - Incubation des plasmas Les plasmas à tester sont dilués à 1:500 dans du PBS-Tween-BSA 0.1%. Des anticorps polyclonaux de lapins anti-TNF-a recombinant humain (Endogen) sont utilisés à la même dilution et servent de témoins positifs. Lavages identiques aux précédents. - Anticorps secondaires Le conjugué est le même que pour TELISA "antigènes de tiques". Il est dilué à 1:1000 dans PBS-Tween-BSA 0.1%. Lavages comme précédemment - Substrat PNPP lmg/ml de diéthanolamine-HCI (pH 9.8,0.5mM MgCl3); incubé comme pour I1ELISA "antigènes de tiques". - Lecture Elle se fait à 405nm au spectrophotomètre (Autoreader MH 580, Dynatech). Les résultats sont exprimés de Ia même manière que dans l'ELISA "antigènes de tiques", par rapport aux valeurs obtenues pour le témoin positif. B. Immunodiffusion radiale La méthode de dosage décrite ci-dessous est reprise de Ingild (1983). - Préparation des plaques Une solution de 1% d'agarose (type M, LKB/Pharmacia) dans du tampon barbital pH 8.6 (tableau E) est chauffée sous agitation constante. Le mélange est dégazé à 500C, puis porté à 900C pour que l'agarose fonde complètement. La solution est ensuite refroidie à 55-600C et maintenue à cette température dans un bain-marie. Des anticorps spécifiques de la substance à doser sont mélangés à l'agarose, qui est ensuite déposé en couche mince de 1.5mm sur un film plastique (GelBond film, LKB/Pharmacia) posé à plat sur une plaque chauffante réglée à 55°C. Le gel est régulièrement étalé à l'aide d'une pipette pasteur, puis refroidi toujours en position horizontale. Les gels se conservent à 4°C en chambre humide jusqu'à utilisation. Annexes 81 - Incubation des sérums Dea puits de 2.5mm de diamètre séparés d'au moins 1.5cm sont formés dans les gels à l'aide d'un emporte-pièce. Les sérums à tester sont dilués dans du tampon barbital pH 8.6 et distribués à raison de Sul/puits. La diffusion se déroule en atmosphère humide à température ambiante. H se forme des disques de précipitation dont le diamètre sera mesuré après séchage et coloration des gels. - Elimination des protéines non précipitées La diffusion est terminée lorsque toutes les molécules d'antigène ont réagi avec les anticorps du gel, et formé des complexes iminyp» qui précipitent dans le gel (anneau de précipitation marginal visible). Les gels sont alors baignés dans une solution de NaCl 0.3M pendant 30 à 60 minutes, puis déposés sur une surface plane et recouverts de 3 à 4 couches de papier filtre (Whatman n° 1) imbibés d'HaO distillée. Une dixaine de couches de papier ménage sec sont ajoutées et une légère charge (plaque de verre) est appliquée. Lorsque tout Ie papier s'est humidifié, les gels sont trempés dans H3O distillée pendant 5 à 10 minutes. - Séchage des gels Sortis de l'eau, les gels sont placés sur une plaque chauffante réglée à 400C, recouverts à nouveau de papier Whatman mouillé, de papier ménage sec et de la plaque de verre. Lorsque le papier s'est humidifié, la plaque est enlevée. Les gels sont laissés ainsi jusqu'à ce que tout le papier placé au-dessus d'eux ait complètement séché. Les gels sont alors réduits à un film transparent étalé sur le GelBond. • Coloration des gels Les gels sont colorés pendant 5 minutes avec du bleu brillant de Coomassie R250 (0.5% dans methanol 45%, acide acétique glacial 10%, H3O dist. 45%). L'excès de colorant est éliminé par plusieurs lavages avec la solution décrite ci-dessus, sans le colorant. Les gels sont séchés et peuvent être conservés ainsi indéfiniment. • Lecture des résultats Le diamètre des disques de précipitation est mesuré à l'aide d'une loupe (Olympus) munie d'un occulaire gradué. Sur chaque gel, une série de cinq concentrations connues de l'antigène à doser permet l'établissement d'une droite standard. En effet, pour une concentration d'anticorps donnée, la concentration de l'antigène reconnu et le carré du diamètre du disque de précipitation mesuré dans le gel augmentent linéairement (c = à"). Cette droite permet ensuite de déduire des concentrations inconnues du même antigène contenus dans des échantillons à doser. Dosage du C3 et des IgM sériques - Anticorps spécifiques Les concentrations ont été fixées lors de la mise au point du test: Annexes 62 - sérum de chèvre anti-C3 de lapin (BioScience) à la concentration de 1.5ul/ml de gel d'agarose - sérum de chèvre antt-IgM de lapin (Kirkegaard & Perry Lab.) à la concentration de 2.5ul/ml de gel. - Dilution des serums à tester Les dilutions sont de 1:16 pour le dosage du C3 et de 1:11 pour celui des IgM. Comme nous ne disposons pas d'antigènes purifiés pour l'établissement des courbes standard, un sérum commercial de lapin (Gibco) est utilisé comme référence. Cinq dilutions sont placées sur chaque gel (voir exemple figure D): - pour le dosage du C3:1:4,1:6,1:11,1:16 et 1:51 dans le tampon barbital pH 8.6. La concentration 1:16 (la même que pour les échantillons à tester) est définie comme la concentration de référence équivalent à 100%. Les autres dilutions seront exprimées en pourcent par rapport à cette concentration de référence: 400%, 266.67%, 145.45%, 100% et 31.37%. • pour le dosage des IgM: 1:2,1:4,1:6,1:11 et 1:31, qui donnent après transformation en pourcent: 550%, 275%, 183.33%, 100% et 35.5%. - Incubation des gels L'anneau épais marquant Ia fin de la diffusion est visible en transparence dans le gel aprèB environ 48h pour le C3 et 72h pour les IgM. 0-1------------,------------,------------,------------, 31.37% 100% 145.45% 266.67% 400% Figure D: Immunodiffusion radiale. Exemple de droite standard. La dilution 1/15 est utilisée comme référence équivalent à 100%. Les autres dilutions sont exprimées en % par rapport à cette référence. Bibliographie 54 Bibliographie ABDUL-AMIR, I.M. & GRAT, J.S. (1987) Resistance of sheep to laboratory infestations of the tick, Ixodes ricinus. Research in Veterinary Science 43, 266-267. ABRAHAM, E., Shah, S. (1992) Intranasal immunization with liposomes containing IL-2 enhances bacteria] polysaccharide antigen-specific pulmonary secretory antibody response. Journal of Immunology 149, 3719-3726. ACKERMAN, S., CLARE, P.B., MOGOL, T.W. & SONENSHINE, D.E. (1981) Passage of host serum components, including antibody, across the digestive tract of Dermacentor variabilis (Say). Journal of Parasitology 67, 737-740. AESCHLIMANN, A. (1972) Ixodes ricinus, Linné 1758 (Ixodoidea, Ixodidae). Essai préliminaire de synthèse sur la biologie de cette espèce en Suisse. Acta Tropica 29, 321-340. AESCHLIMANN, A., BrossaRD, M. & QUENET, G. (1975) Contribution à la connaissance des piroplasmes en Suisse. Acta tropica 32, 281-289. 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Ma gratitude s'adresse également à la direction et au personnel du laboratoire Bio-Vet de Ciba-Geigy à Saint-Aubin, et plus particulièrement au Dr. Serge Martinod et à Mme Béatrice Siegenthaler-Daflon, pour m'avoir accueillie dans leurs locaux et permis d'apprendre certaines techniques nécessaires à mon travail. Je garde un souvenir merveilleux de ce séjour. Je remercie aussi toutes les personnes qui m'ont aidée et encouragée dans la réalisation de ce travail: - Le Professeur André Aeschlimann, pour sa bienveillance paternelle ù mon égard, et pour m'avoir donné le goût à la parasitologic. - Mme Marlene Knutti, pour sa collaboration et les soins prodigués aux animaux de l'animalerie. • Olivier Rais et Albin Collaud, pour leurs innombrables coups de main "au bon moment". • Mme Jacqueline Moret, pour ses conseils concernant le traitement statistique des résultats. - Les Dr Bernard Rutti, Jean-Marc Weber et Patrick Guerin pour l'aide aux corrections des manuscrits de publications. - Le Dr Ellen M. Dotson pour les améliorations apportées au résumé anglais du manuscript de thèse. - Mme Josiane Pont, pour sa disponibilité et son aide dans mes recherches bibliographiques. - L'équipe du labo d'Immunologie, pour les discussions souvent fructueuses et tous les petits services rendus. - Le personnel du Diagnostique parasitaire, toujours prêt à "être dérangé" pour n'importe quoi, avec le sourire. - Toutes les personnes amies de l'institut de Zoologie, avec une pensée émue et triste pour Jacques Beuret, pour les bons moments passés "au thé" et ailleurs... Enfui, je tiens à remercier tout particulièrement mon ami Jean-Marc, ainsi que mes parents, pour leur soutien moral tout au long de ces années de thèse. Ce travail a bénéficié du soutien financier du Fonds National Suisse pour la Recherche Scientifique, bourse c°3.628.087. Bibliographie 99 Wheeler, CM., Coleman, J.L., Habicht, G.S. & Benach, J.L. 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