Login
Characterization of the microbial community in raw milk cheese by high-throughput qPCR
Résumé Au cours des dernières décennies, les méthodes indépendantes de la culture ont été largement utilisées pour la recherche et le diagnostic en microbiologie alimentaire. Ces méthodes permettent une détermination rapide et précise de la composition microbienne d'une variété d'aliments. Récemment, la PCR quantitative (qPCR) et le séquençage de nouvelle génération (NGS), notamment le séquençage des amplicons du gène de l'ARNr 16S, ont été fréquemment utilisés pour étudier la composition microbienne du fromage et son influence sur la qualité du fromage. Cependant, ces méthodes sont relativement complexes et coûteuses pour une utilisation plus répandue, par exemple pour le contrôle de routine de la qualité du fromage dans les fromageries. Un avantage de la qPCR par rapport au NGS est la quantification des espèces bactériennes ciblées dans le fromage; cependant, il y a aussi un désavantage concernant le débit et la couverture de la population bactérienne. Il y a quelques années, le développement de nouvelles technologies dans le domaine de la microfluidique a permis d'augmenter le débit des systèmes qPCR, rendant possible la réalisation d'analyses qPCR sur un plus grand nombre d'échantillons et de tests avec un effort réduit. L'objectif de cette thèse était de développer les bases d'un système qPCR à haut débit (HT-qPCR) pour la quantification d'espèces bactériennes importantes pour la qualité des fromages au lait cru, qui serait applicable pour la recherche ainsi que pour le diagnostic des problèmes de qualité.

Dans ce but, un pipeline automatisé pour la conception d'amorces qPCR spécifiques aux espèces a été développé et validé. Au total, 23 nouveaux systèmes d'amorces ont été conçus pour cibler les espèces bactériennes couramment utilisées dans les starters ou les bactéries lactiques non starters présentes dans les fromages au lait cru. La performance de ces systèmes d'amorces en combinaison avec le système HT-qPCR a été validée en utilisant des extraits d'ADN de cultures bactériennes pures et de fromages modèles inoculés. De plus, les performances de la HT-qPCR et du séquençage des amplicons du gène de l'ARNr 16S ont été comparées pour déterminer la composition microbienne de 21 fromages Raclette du Valais.

Dans cette thèse, les concepts de base du développement d'un système HT-qPCR pour la quantification de certaines des espèces bactériennes les plus importantes pour la qualité du fromage ont été décrits. L'application et l'utilité de ce système pour la recherche microbiologique des aliments fermentés ont été démontrées. Une application potentielle de cette nouvelle approche serait l'étude du développement de la communauté bactérienne pendant la maturation. La poursuite du développement du système modulaire pourrait faciliter le dépistage rapide et économique des espèces bactériennes importantes pour la qualité des fromages avant et pendant la maturation, assurant ainsi un contrôle continu de la qualité pendant la fabrication des fromages au lait cru.

Abstract
In recent decades, culture-independent methods have been extensively used for research and diagnostics in food microbiology. These methods allow a rapid and accurate determination of the microbial composition in a variety of foods. Recently, quantitative PCR (qPCR) and next-generation sequencing (NGS), especially 16S rRNA gene amplicon sequencing, were frequently used to investigate the microbial composition of cheese and its influence on cheese quality. However, these methods are relatively complex and expensive for a more widespread use, for instance, for the routine monitoring of cheese quality in cheese dairies. An advantage of qPCR over NGS is the quantification of the targeted bacterial species in cheese; however, there is also a trade-off in throughput and the bacterial population coverage. A few years ago, the development of new technologies in microfluidics enabled higher throughput for qPCR systems, making it possible to perform qPCR analyses on larger numbers of samples and assays with reduced effort. The aim of this thesis was to develop the basis for a high-throughput qPCR (HT-qPCR) system for the quantification of quality-relevant bacterial species in raw milk cheese, which would be applicable for research as well as for the diagnosis of quality problems.

For this purpose, an automated pipeline for the design of species-specific qPCR primers was developed and validated. In total, 23 new primer systems were designed targeting bacterial species commonly used in starters or present as part of the non-starter lactic acid bacteria in raw milk cheeses. The performance of these primer systems in combination with the HT-qPCR system were validated using DNA extracts from pure bacterial cultures and inoculated model cheeses. Further, the performance of HT-qPCR and 16S rRNA gene amplicon sequencing to determine the microbial composition of 21 Raclette du Valais cheeses was compared.

In this thesis, the basic concepts of the development of a HT-qPCR system for the quantification of some of the most important bacterial species with relevance to cheese quality were described. The application and usefulness for microbiological research of fermented foods was demonstrated. A potential application of this novel approach is the study of the bacterial community development during ripening. Further development of the modular system could eventually facilitate the rapid and economical screening of quality-relevant bacterial species in cheeses before and during ripening, thus ensuring continuous quality control during the manufacture of raw milk cheeses.
   
Mots-clés Conception de primer qPCR; Bioinformatique; composition de la communauté microbienne; microfluidique; qualité du fromage; microbiome du fromage; aliments fermentés; microbiologie alimentaire; qPCR primer design; Bioinformatics; microbial community composition; microfluidics; cheese quality; cheese microbiome; fermented food; food microbiology
   
Citation Dreier, M. (2022). Characterization of the microbial community in raw milk cheese by high-throughput qPCR, Université de Neuchâtel, Neuchâtel.
   
Type Thèse (Anglais)
Année 2022
Université Université de Neuchâtel (Neuchâtel)