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Bacterial oxalotrophy as an alternative biocontrol approach for the fight against pulmonary aspergillosis
Résumé On estime que les champignons tuent plus de 1,5 million de personnes chaque année dans le monde. Malgré cela, la question de la pathogenèse fongique est largement négligée. De plus, l’augmentation de l’émergence de pathogènes fongiques multi-résistants dans le monde constitue une menace majeure pour la santé humaine. C’est notamment le cas des moisissures du genre Aspergillus, dont la prévalence des infections, également connues sous le nom d’aspergilloses, a augmenté de façon spectaculaire au cours des dernières années. Les espèces d’Aspergillus, telles que A. fumigatus, A. flavus, A. nidulans, A. terreus ou A. niger, sont à l’origine d’un vaste éventail de maladies respiratoires, allant des allergies légères aux infections invasives potentiellement mortelles. Dans ces derniers cas, il est intéressant de noter que la formation de cristaux d’oxalate de calcium a été précédemment observée. L’acide oxalique est connu pour jouer un rôle clé dans la pathogenèse des champignons phytopathogènes, comme par exemple Sclerotinia sclerotiorum. Cependant, un lien entre production d’acide oxalique et pathogénicité n’a pas encore été établi dans le cas d’Aspergillus.

L’acide oxalique, ainsi que d’autres acides organiques de faible poids moléculaire, est couramment produit par les champignons telluriques. Dans les sols, l’acide oxalique se présente généralement sous la forme de cristaux d’oxalate de calcium. Malgré sa stabilité chimique et sa faible solubilité, l’oxalate de calcium est rarement retrouvé dans les archives géologiques, ce qui peut être expliqué par l’activité de bactéries oxalotrophes. Dans le sol, l’interaction entre les champignons oxalogènes et les bactéries oxalotrophes au sein de la voie oxalate-carbonate est connue. L’oxalotrophie s’accompagne d’une augmentation locale de pH conduisant à la précipitation de carbonate de calcium si le pH augmente au-dessus d’une valeur de 8.4.

L’objectif de cette thèse était d’appliquer à la santé humaine les principes écologiques régissant l’interaction métabolique entre les champignons oxalogènes et les bactéries oxalotrophes dans les sols. Plus spécifiquement, nous avons développé et évalué une nouvelle stratégie de biocontrôle pour le traitement de l’aspergillose pulmonaire basée sur la manipulation de l’environnement par l’oxalotrophie bactérienne, un processus que nous avons nommé interférence environnementale. Pour cela, l’influence de la composition du milieu de culture sur la production d’acides organiques de faible poids moléculaire par certaines souches fongiques, ainsi que sur leur interaction avec des souches bactériennes oxalotrophes ou non-oxalotrophes, a été testée. La souche fongique Aspergillus niger a été sélectionnée en raison de sa production systématique d’acide oxalique dans tous les milieux de culture testés, et de son intérêt médical. La première démonstration in-vitro du principe d’interférence environnementale a été faite en montrant le contrôle exercé par l’espèce bactérienne oxalotrophe Cupriavidus oxalaticus sur la croissance de A. niger. L’utilisation d’une bactérie tellurique s’est avérée problématique, car elle induit des dommages cellulaires importants. Par conséquent, le génome de C. oxalaticus a été analysé afin de mieux comprendre le métabolisme de l’oxalotrophie chez cette bactérie modèle. Ceci a permis de mettre en évidence la présence d’un opéron contenant les gènes impliqués dans la dégradation de l’oxalate. Ces données seront utilisées pour la conception d’une voie de dégradation de l’oxalate entièrement enzymatique qui sera plus adaptée pour une potentielle option thérapeutique. Enfin, l’interaction champignon:champignon:bactérie entre A. niger, Candida albicans et C. oxalaticus a été étudiée. Cette interaction est pertinente dans le cas de co-infection pulmonaire chez les patients immunodéprimés et les patients souffrant de mucoviscidose. L’interaction des deux pathogènes fongiques opportunistes et de la bactérie oxalotrophe dépendait du mode d’inoculation (simultané ou séquentiel). En conclusion, bien que les résultats présentés sur le concept de biocontrôle par interférence environnementale soient prometteurs, une démonstration précliniquein-vivo de ce concept dans un modèle d’infection murin est cruciale pour le développement d’une potentielle application clinique. En effet, une approche plus complète intégrant le système immunitaire est nécessaire afin de mieux comprendre l’interaction entre l’hôte, le pathogène et le microbiote pulmonaire dans le développement de la maladie.

Abstract

Although fungi are estimated to kill more than 1.5 million people every year worldwide, the issue of fungal pathogenesis is largely neglected. Moreover, the rise of emergence of multi-resistant fungal pathogens worldwide is a major threat for human health. This is notably the case of the opportunistic fungal pathogens of the genus Aspergillus. The prevalence of Aspergillus-related infections, also known as aspergillosis, has dramatically increased in the last few years. Aspergillus species, such as A. fumigatus, A. flavus, A. nidulans, A. terreus or A. niger, are known to cause a vast spectrum of respiratory diseases, ranging from mild allergies to life-threatening invasive infections. Interestingly, the formation of calcium oxalate crystals has been previously reported in the latter cases. Oxalic acid is known to play a key role in the pathogenesis of plant fungal pathogens, such as for instance Sclerotinia sclerotiorum. However, a link between the production of oxalic acid and pathogenicity has not been made yet in the case of Aspergillus.

Oxalic acid is commonly produced by soil fungi, along with other low molecular weight organic acids. In soils, oxalic acid generally occurs in the form of calcium oxalate crystals. Despite its chemical stability and low solubility, calcium oxalate is rarely found in the geological records, something that has been suggested to be the results of its metabolization by oxalotrophic bacteria. Oxalogenic fungi are known to interact with oxalotrophic bacteria in soils within the oxalate-carbonate pathway, where fungi, along with plants, are the source of oxalate, and oxalotrophic bacteria are its sink. Oxalotrophy is concomitant with a pH increase, which eventually leads to the precipitation of calcium carbonate, if the pH increases above a value of 8.4.

The aim of the present thesis was to translate the metabolic interaction between oxalogenic fungi and oxalotrophic bacteria occurring in soils to human health. Specifically, we developed and assessed a novel biocontrol strategy for the treatment of pulmonary aspergillosis based on the manipulation of the environment through bacterial oxalotrophy, a process we named environmental interference. For this, the influence of the composition of the culture medium on the production of low molecular weight organic acids was tested for selected fungal strains, as well as their interaction with non-oxalotrophic and oxalotrophic bacterial strains. The fungal strain Aspergillus niger was selected because of its systematic production of oxalic acid in all culture media tested, and because of its medical relevance. The first demonstration of the principle of environmental interference in-vitro was made by showing the biocontrol exerted by the oxalotrophic bacterial species Cupriavidus oxalaticus on the growth of A. niger. The use of soil bacteria was shown to be problematic, as they induce important cellular damage. Therefore, the genome of C. oxalaticus was analyzed in order to better understand the oxalotrophy metabolism in this model bacterial species. This highlighted the presence of an operon containing all the genes that are required for the degradation of oxalate. These data will be used for the design of an entirely enzymatic degradation pathway of oxalate that will be more suitable as a potential therapeutic option. Finally, the fungal:fungal:bacterial interaction between A. niger, Candida albicans and C. oxalaticus was investigated. This interaction is relevant in the case of pulmonary co-infection in immunocompromised patients and patients suffering from cystic fibrosis. The interaction of both opportunistic fungal pathogens and the oxalotrophic bacterium depended on the inoculation mode (simultaneous versus sequential). To conclude, while the presented results on the biocontrol concept of environmental interference are promising, a preclinical in-vivo demonstration of this concept in a murine infection model is crucial for the development of a potential clinical application. Indeed, a more comprehensive approach by integrating the immune system is necessary in order to better comprehend the interplay between the host, the pathogen and the lung microbiota in disease development.
   
Mots-clés Champignons pathogènes opportunistes; résistance antifongique; Aspergillus spp.; Aspergillus niger; acide oxalique; oxalate de calcium; bactéries oxalotrophes; Cupriavidus oxalaticus; interaction bactérie:champignon; interférence environnementale; Candida albicans; interaction champignon:champignon:bactérie; écologie microbienne; opportunistic fungal pathogens; antifungal resistance; Aspergillus spp.; Aspergillus niger; oxalic acid; calcium oxalate; oxalotrophic bacteria; Cupriavidus oxalaticus; bacterial:fungal interaction; environmental interference; Candida albicans; fungal:fungal:bacterial interaction; microbial ecology
   
Citation Palmieri, F. (2021). Bacterial oxalotrophy as an alternative biocontrol approach for the fight against pulmonary aspergillosis, Doctorat, Université de Neuchâtel, Neuchâtel.
   
Type Thèse (Anglais)
Année 2021
Departement academique Institut de biologie
Université Université de Neuchâtel (Neuchâtel)
Degré Doctorat